水稻脂肪氧化酶3（LOX3）互作蛋白的筛选及蛋白组学分析结果验证

发布时间：2020-08-02 21:19

【摘要】：水稻是世界上最重要的粮食作物之一,其在保存的过程中容易发生霉变、陈化变质等问题,造成大量的粮食损失。水稻耐储性问题也成为育种家所面临的主要挑战之一。前期研究基础表明,脂肪氧化酶3(LOX3)是水稻种子脂肪氧化过程中的关键酶,LOX3的缺失、反义和干扰表达可提高水稻种子的耐储藏性,但其具体作用机理尚不清楚。本研究利用实验室前期构建的差异蛋白表达谱,剖析LOX3代谢途径,明确LOX3如何与上、下游基因协调作用,影响稻谷的耐储性;同时利用酵母双杂交系统筛选LOX3的互作蛋白,结合GST pull-down技术对筛选的互作蛋白进行验证,进而明确水稻种胚LOX3代谢途径以及LOX3参与调控稻谷耐储性的分子机理。主要研究结果如下:1.构建了 pGBKT7-LOX3的酵母双杂交诱饵载体,自激活实验结果表明pGBKT7-LOX3不存在自激活现象,将诱饵载体与cDNA文库杂交,通过四缺培养基筛选得到互作蛋白,构建pGADT7载体进行共转复筛,最终筛选出了 2个与LOX3可能互作的蛋白质,对应基因分别为:Os02g0758000和Os09g0438700。2.构建了带有pMAL标签pMAL-c5X-LOX3原核表达载体,带有GST 标签的 pGEX-6P-1-Os0990g38700和pGEX-6P-1-Os02g0758000原核表达载体,转化BL21菌株,经诱导后获得经SDS-PAGE分析,得到 pMAL-LOX3,GST-Os09g0438700和GST-Os09gg0758000融合蛋白。3.通过对种胚LOX3相关代谢通路分析,选择6个在转反义LOX3基因水稻种子老化前、后差异显著蛋白,其对应的基因分别为:Os01g0348600,Os11g0605500,Os06g0204400,Os02g0116500,Os09g0570300,Os02g0676000。通过qRT-PCR技术分析在老化处理前后这些基因表达量的变化情况。结果发现,6个基因在转基因种子与对照种子老化处理前后的表达量变化差异显著,与前期蛋白质组学结果一致。
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S511
【图文】：

用枪头吹打混匀，从管２吸５＾Ｌ至管３，ｌ0Ｘ，邋１００ｘ，ｌＯＯＯｘ，邋ｌＯＯＯＯｘ稀释菌液５叫点缺培养基上；逡逑ｉｎ，等菌落完全干燥，置于３０°Ｃ培养３－５ｄ；逡逑酵母ＡＨ１０９中一种半乳糖苷酶ＭＥＬ１的显，阳性菌落会显示为蓝色，该方法快速简单，而无需进行复杂的ａ－半乳糖苷酶活性检测。通否为阳性。逡逑析逡逑因克隆逡逑获取的基因的ｃＤＮＡ作为模板，用设公司的Ｇｌｅｆｘ高保真酶进行目的基因的扩增，胶电泳分析，（如图２－１所示）。查阅ＮＣＢＩ网ｐ，图中所示产物特异性条带约为２，６００ｂｐ，与Ｍ逡逑ｍ

将ｐＧＢＫＴ７－ＬＯＯ与ＡＤ－ｌｉｂｒａｒｙ共转到ＡＨ邋１０９酵母菌株中，分别涂布于逡逑ＳＤ／－ｌｅｕ／－ｔｒｐ／培养基和ＳＤ／－ａｄｅ／－ｌｅｕ／－ｔｒｐ／－ｈｉｓ培养基中，于３０°Ｃ培养箱倒置培养６ｄ，逡逑后观察菌落长势，结果如图２－６所示，结果表明在二缺培养基上长势较好，而四逡逑缺培养基上菌落数量明显减少，但仍有约６０个左右单克隆菌。逡逑图２－６酵母菌落在缺陷培养基上的生长情况逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－６邋Ｙｅａｓｔ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｏｎ邋ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ邋ｍｅｄｉｕｍ逡逑Ａ．ＳＤ／－ｌｅｕ／－ｔｒｐ；Ｂ．ＳＤ／－ａｄｅ／－ｌｅｕ／－ｔｒｐ／－ｈｉｓ逡逑挑选多个长势较好的单克隆菌落，用文库通用引物Ｔ７／３’ＡＤ进行菌液ＰＣＲ逡逑扩增，并用琼脂糖凝胶电泳检测是否插入片度以及插入片段的大小，ＰＣＲ结果逡逑如图所示：逡逑２２逡逑

１Ｘ邋１０Ｘ邋１0２Ｘ邋１0３Ｘ邋１0４Ｘ逡逑ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ！逡逑图２－５诱饵蛋白自激活特性检验逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－５邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａｕｔｏ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ邋ｆｏｒ邋ｂａｉｔ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑２．３．４酵母双杂交文库筛选逡逑将ｐＧＢＫＴ７－ＬＯＯ与ＡＤ－ｌｉｂｒａｒｙ共转到ＡＨ邋１０９酵母菌株中，分别涂布于逡逑ＳＤ／－ｌｅｕ／－ｔｒｐ／培养基和ＳＤ／－ａｄｅ／－ｌｅｕ／－ｔｒｐ／－ｈｉｓ培养基中，于３０°Ｃ培养箱倒置培养６ｄ，逡逑后观察菌落长势，结果如图２－６所示，结果表明在二缺培养基上长势较好，而四逡逑缺培养基上菌落数量明显减少，但仍有约６０个左右单克隆菌。逡逑图２－６酵母菌落在缺陷培养基上的生长情况逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－６邋Ｙｅａｓｔ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｏｎ邋ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ邋ｍｅｄｉｕｍ逡逑Ａ．ＳＤ／－ｌｅｕ／－ｔｒｐ；Ｂ．ＳＤ／－ａｄｅ／－ｌｅｕ／－ｔｒｐ／－ｈｉｓ逡逑挑选多个长势较好的单克隆菌落，用文库通用引物Ｔ７／３’ＡＤ进行菌液ＰＣＲ逡逑扩增，并用琼脂糖凝胶电泳检测是否插入片度以及插入片段的大小，ＰＣＲ结果逡逑如图所示：逡逑２２逡逑

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