基于体外雄核发育的穿心莲单倍体新种质创制研究

发布时间：2020-08-11 10:52

【摘要】：穿心莲为闭花授粉植物,由于其品种单一、多样性低导致产量下降、有效成分含量降低等问题。开展高产、优质新种质的培育研究迫在眉睫。传统方法选育新品种一般要经过5~7年自交,才能育出稳定的品种。体外雄核发育是诱导游离小孢子(花粉)离开原来配子体的单细胞体外发育途径。单倍体育种可以极大缩短育种周期,有助于选育高产、质优、抗逆性好、抗病能力强的新品种,可以为穿心莲品质改良和种质创新提供新途径。本项目采用染色体倍性育种技术,培育穿心莲单倍体植株,重点考察不同生长发育时期穿心莲小花花药小孢子的活力;供体植株生长状况、小孢子发育时期、预处理、激素对穿心莲单倍体植株诱导的影响;穿心莲单倍体、二倍体植株、同源四倍体的染色体倍性及穿心莲总内酯含量检测。本研究为基于染色体工程选育产量高、有效成份含量高、品质优良的穿心莲新种质提供技术支持,为穿心莲种质资源的可持续利用及产业化种植推广提供理论依据和技术基础。(1)对穿心莲的花进行解剖学研究,通过穿心莲花序及小花形态结构观察、体视镜下解剖、显微鉴别等方法对穿心莲花的形态及显微结构进行探究。穿心莲的花序为总状花序,小花长度1.3~1.5cm,全花附腺毛和微毛;花萼5,披针形;唇形花冠,上唇瓣两瓣合生1浅裂,白色;下唇瓣三瓣合生2深裂,有深紫色斑纹;雄蕊2,花药连生,花丝有白色绒毛;雌蕊1,柱头伸至两花药之间,子房上位,2心皮,2室,中轴胎座;花粉粒长椭圆形或圆球形,表面具浅纹,有纵沟,3个萌发孔;穿心莲花药壁由表皮、药室内壁和绒毡层组成;花粉小孢子有单核期,双核期与成熟期,单核期的小孢子又分为单核居中期与单核靠边期。上述鉴别特征可用于确定穿心莲花粉发育时期与穿心莲小花之间的对应关系。(2)以穿心莲花粉为实验材料,明确穿心莲小花供体生长阶段、采集时间与穿心莲花粉活力之间的关系,建立穿心莲花粉体外萌发最适培养条件,比较I_2-KI染色法、TTC染色法染色效果。通过I_2-KI染色法、TTC染色法、离体萌发法测定不同时期和采集时间的穿心莲花粉活力;采用离体培养法研究不同培养基组分和预处理对花粉管萌发的影响。以碘-碘化钾染色法测定花粉活力,15:00采集的药丝比为1:4的花粉染色率最高;用TTC染色法测定花粉活力,15:00采集的药丝比为1:6的花粉染色率最高,TTC法测定的花粉活力趋势与花粉管萌发法测定的花粉活力趋势相同,均为花粉活力随着药丝比的减少而成增高趋势。穿心莲花粉离体萌发较为适宜的培养基组合为:10%蔗糖+0.3 g·L~(-1)氯化钙+1 g·L~(-1)硼酸+15%PEG,萌发率为82.5%。预处理条件对穿心莲花粉离体萌发有显著影响,4℃冷处理24 h能显著提高花粉萌发率(P0.05)。4℃冷处理48 h与30℃热处理24 h的穿心莲花粉管萌发率与对照组无显著差异。但30℃热处理48 h组可得出,随着热处理时间的增长,花粉管萌发率有下降趋势。(3)以穿心莲的小花为实验材料,明确穿心莲单倍体愈伤组织最优的诱导条件和分化条件。在无菌条件下以穿心莲花粉小孢子悬浮液和花药为实验材料。以MS为基本培养基花粉小孢子悬浮液与花药均不能产生肉眼可见的愈伤组织。在以N6培养基为基本培养基的正交试验中,愈伤组织的诱导率为12.96%。最优水平组合为A2B1C2D3,即1.0 mg·L~(-1)PP333、1.0 mg·L~(-1)KT、0.5 mg·L~(-1)2,4-D、0.5 mg·L~(-1)NAA。在Nistch培养基上的最高诱导率20.34%高于在N6培养基上的最高诱导率12.96%。但是在Nistch培养基上接种的花药诱导时间长,继代培养的过程中极易褐化,多次转瓶,添加活性炭均不能抑制褐化,不利于实验结果的统计,不不适宜用来诱导穿心莲单倍体。选择生活状态良好的深绿色愈伤组织,转入以下培养基中:N6+2.0 mg·L~(-1)6-BA+0.5 mg·L~-11 NAA+50 mL·L~(-1)椰汁,培养30d,愈伤组织分化出胚根,形态学上端深绿色呈心形。(4)采用染色体制片法和流式细胞术法鉴定诱导得到的胚性愈伤组织的染色体倍性,并且与正常倍性的穿心莲植株和实验室诱导的同源四倍体植株对比。最佳的染色体制片方法为:在2000 mg·L~(-1)秋水仙素溶液中处理2 h,冰箱4℃暗处理,蒸馏水漂洗5次,每次5 min;将预处理好的根尖材料转入卡诺氏固定液[无水乙醇:冰醋酸(3:1)]中迅速杀死细胞,固定24小时以上,放置于4℃冰箱中进行暗处理,蒸馏水漂洗5次,每次5 min;取固定好的根尖,转入1 mol·L~(-1)盐酸溶液中60℃恒温水浴解离,解离20 min,蒸馏水漂洗5次,每次5min;解离好的材料放在载玻片上,用刀片切去伸长区,只留下1~2 mm的分生组织,滴一滴改良石碳酸品红染色液染色5 min后,用稀醋酸洗去多余的改良石炭酸品红染色液,即可进行压片,显微镜检,拍照记录。穿心莲单倍体愈伤组织染色体X=12、二倍体染色体2X=24、同源四倍体染色体4X=48,经体外雄核发育的穿心莲愈伤组织染色体为原二倍体植株的1/2,鉴定为穿心莲单倍体愈伤组织,经染色体加倍后的植株染色体数目为原二倍体植株的2倍,即为同源四倍体。(5)采用高效液色谱法测定不同倍性穿心莲植株有效成分穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量,明确穿心莲染色体不同倍性类型与药材产量及穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量的相关性。穿心莲单倍体胚性愈伤组织中心莲内酯含量(0.660 mg·g~(-1)二倍体和同源四倍体分别为8.836、7.299 mg·g~(-1),穿心莲四倍体的脱水穿心莲内酯含量(2.893 mg·g~(-1))比二倍体(0.659 mg·g~(-1))高,是二倍体的439%,具有显著性意义。脱水穿心莲内酯主要来源于穿心莲植株的叶,穿心莲单倍体愈伤组织还未能分化出叶片,未能积累脱水穿心莲内酯。此方法可用于分化后穿心莲单倍体植株的品质评价。
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S567.219
【图文】：

穿心莲,小花,花序

图 1 穿心莲的花序与小花g.1 The inflorescence and flowers of Andrographis paniculata（ Burm.f.）N由图 1 可知，穿心莲花序为总状花序，花从近主茎段开始开放，小花盛花时1.5cm，全花附腺毛和微毛；5 花萼；唇形花冠，上唇瓣两瓣合生 1 浅裂，瓣三瓣合生 2 深裂，有深紫色斑纹；雄蕊 2，雌蕊 1。穿心莲花序与小花形

体视镜,下穿,莲花,雌蕊

图 2 体视镜下穿心莲花的结构B 下唇瓣（内侧） C 下唇瓣（外侧） D 上唇瓣 E 雄蕊 F 雌蕊 G 花药包围型雌蕊（H 花药包围型雌蕊（后面观） I 子房 J 子房（纵剖） K 子房（横切）he structure of the flowers of Andrographis paniculata（B. f.）Nees ustereoscope B Inferior labial flap（inside） C Inferior labial flap（outside D Ep

穿心莲,花药,显微镜下,横切

图 3 显微镜下穿心莲花药横切结构显微镜下穿心莲花药横切结构（×40） B 显微镜下穿心莲花药横切结构（×1001 药隔维管束 2 花药壁表皮 3 药室内壁 4 绒毡层 5 药室 6 花粉细胞 The anther crosscutting structure of Andrographis paniculata（ Burm.fA（×40） B（×100）lar bundle 2 Cuticular layer 3 Endithecium 4 Taoetum 5 Anther cell grain图 3 可知，通过对冷冻切片研究发现可见药隔中的维管束，穿心莲花药子。穿心莲花药壁表皮细胞扁平，细胞壁壁薄，有腺毛；药室内壁细胞齐；绒毡层细胞是花药壁最内的一层，可见残余的绒毛。两个药室远基粉小孢子的暴露。.1.3.2.2 穿心莲花药壁、柱头与花粉粒显微结构花药壁和花粉粒，置于载玻片上的水滴中，加盖玻片做成玻片标本（临时水合氯醛试液处理后在显微镜下观察、拍照、作好记录，见图 4。

【参考文献】