水稻叶鞘花青素合成的分子机制和自发突变基因快速克隆新方法

发布时间：2020-08-15 10:34

【摘要】：第一部分:花青素是植物三大色素之一,具有吸引昆虫传粉,免受病虫害伤害以及防止紫外线伤害等作用。花青素的合成途径在各种植物中相对保守,受到结构基因和调节基因的双重调控:其中结构基因主要是编码花青素合成途径中的各种催化酶;而调节基因主要是MYB类、bHLH类及WD40类的转录因子,调控各类结构基因的时空表达。花青素在水稻叶鞘中合成和累积会形成紫色的叶鞘。叶鞘紫色性状是一个肉眼可辨的性状,受到质量基因控制。我们通过正向遗传学的方法克隆了调控水稻叶鞘花青素合成的Rb1和Rb2基因。主要结果如下:1.利用珍汕97B和西藏2号构建的重组自交系群体,我们在第1染色体初定位到一个控制叶鞘紫色的基因,命名为PSH1(Purple Sheath 1)。随后通过精细定位的方法将PSH1基因定位到143.9 kb的区间。候选区间包含19个注释基因,其中有4个基因注释为花青素合成的调节基因,编码Lc蛋白。2.通过比较候选基因DNA序列及参考注释信息,我们确定了Rb2(包含LOC_Os01g39560和LOC_Os01g39580的全长序列)为候选基因。该候选基因在日本晴基因组中全长26.1 kb,在珍汕97B基因组中全长27.5 kb。3.在近等基因系NIL-XZ2中超表达珍汕97B的Rb2等位基因,转基因阳性单株在叶鞘叶片中表现出不同程度的花青素积累,Rb2的基因敲除单株的叶鞘花青素含量明显减少。但是敲除单株却不能使叶鞘花青素减少到NIL-XZ2的水平,说明除Rb2外,该区间可能还存在其它的基因调控叶鞘花青素的合成。4.用一个Rb2敲除单株和NIL-XZ2的F_2分离群体,我们在Rb2附近定位到另一个控制叶鞘颜色的基因Rb1。表达量分析发现近等基因系之间Rb1的表达量相差130倍;但Rb1的CDS却没有差异,说明Rb1非编码区的差异可能导致了它的功能差异。Rb1~(ZS97)在NIL-XZ2中超表达的个体与超表达Rb2~(ZS97)表型基本一致,在叶鞘和叶片中出现不同程度的花青素积累。敲除Rb1~(ZS97)的单株叶鞘颜色也减弱。rb1rb2双突变材料的叶鞘颜色基本上恢复到NIL-XZ2的水平,说明Rb1和Rb2共同控制叶鞘花青素的合成。5.表达量分析显示Rb1和Rb2主要调控花青素合成途径下游基因F3H、DFR和ANS的表达。超表达植株中花青素的合成和这三个基因的表达量正相关,而敲除单株叶鞘颜色的深浅与这些基因的表达降低相关。6.异位表达Rb1和Rb2都可以使种皮颜色变紫,类似于“紫稻”。超表达这两个基因虽然不影响育性,但是降低了种子充实度,饱满种子约占总数的10.0%。7.在西藏2号和明恢63组合的F_2群体中,紫色:绿色叶鞘的比例符合9:7的分离比,说明在这个群体里有两个基因控制叶鞘花青素的合成。经过遗传分析证明这两个基因是OsC1和Rb1/Rb2(Rb1和Rb2由于紧密连锁被认为是一个基因)。酵母双杂交证明Rb1、Rb2与OsC1存在互作。第二部分:在组织培养过程中产生的体细胞突变体和自然突变的突变体都属于自发突变体,是基因克隆的重要材料。但是这类突变体与野生型基因组序列差别太小,不可能通过与野生型杂交构建分离群体的策略来克隆突变基因;此外,大多数性状由多基因控制,很难通过与其它品种材料杂交来直接分离突变基因。我们创建了一种快速定位这类突变基因的新方法,主要结果如下:1.一个来自中花11 T-DNA突变体库的突变体表现少分蘖和叶色偏黄的表型。T-DNA插入与突变表型不共分离,猜测它可能是组织培养过程中产生的体细胞突变体。以EMS诱变产生的无表型变异的中花11(中性突变体)为父本和该突变体杂交。F_2代的叶色分离符合3:1的分离比,说明是单基因突变导致的表型变异。2.我们挑选了30个突变体表型的F_2单株进行DNA混合池测序,经过生物信息分析发现LOC_Os07g04840是该突变基因。突变体在第2外显子处存在1 bp的缺失,导致蛋白质移码突变。该基因编码PsbP蛋白。在突变体中超表达野生型中花11的PsbP基因,分蘖数和叶绿素含量均增加,说明PsbP是控制分蘖数和叶色的基因。3.我们用一个9311半卷叶自然突变体与EMS诱变的无表型变异的9311(中性突变体)杂交,用相同的方法证实LOC_Os07g01240就是该突变基因,突变体在第3外显子处存在2 bp的缺失,导致移码突变。该基因编码糖磷脂酰肌醇膜锚定蛋白,是一个已报道的控制卷叶的基因。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S511
【图文】：

花青素,化学结构,查尔酮

也就是花青素的主要存在模式——花青素苷(Houetal2004)（图1）。图 1 花青素的化学结构 (Hou et al 2004)Figure 1 Chemical structure of anthocyanidins花青素合成途径属于类黄酮合成的一个分支途径，最开始由 3 个丙二酰 CoA(Malonyl-CoA)和一个 4-香豆酰 CoA (p-Coumaroyl-CoA)在查尔酮合成酶(chalconesynthase, CHS)的催化作用下形成花青素的基本骨架查尔酮；随后在查尔酮异构酶

水稻品种,叶鞘,稃尖,紫色

华中农业大学 2019 届博士研究生学位（毕业）论文1.3 结果与分析1.3.1 PSH1 的发现籼稻品种 ZS97 的叶鞘、稃尖和柱头均为紫色；而粳稻品种 XZ2 叶鞘整体为绿色，只在基部有轻微的紫色（图 3A，红色边框指示部分），稃尖和柱头均为紫色，这两个亲本组织的颜色差异主要体现在叶鞘上。

遗传连锁图,位置,表型,稳定群

图 4 RIL 群体遗传连锁图和 PSH1 所在位置Figure 4 The genetic linkage map of the RIL populations and the position of PSH11.3.2 PSH1 的基因克隆1.3.2.1 PSH1 的精细定位由于 F0122600457GA 和 F0123996207GA 两个 SNP 标记之间相差约 1400 kb（按照 SNP 物理位置相减），区间较大。并且由于 RIL 群体各基因型已经纯合，无法通过这种稳定群体精细定位并克隆 PSH1，于是我们重新利用 ZS97 和 XZ2 两亲本进行杂交并自交一代得到 F2大群体。ZS97 和 XZ2 的 F1表型介于两亲本之间（图5 A），表明该基因属于不完全显性基因，此外亲本和杂交种的表型随着生长时间逐渐加深，约在插秧后第四周表现最为明显（图 5B），这也是我们调查表型所确定的

【参考文献】