干旱胁迫下百脉根SSH文库构建与分析

发布时间：2020-09-28 17:06

　　 百脉根(Lotus corniculatus)作为优良豆科牧草有很大的利用前景,但干旱限制了其推广利用效率。研究植物在干旱胁迫下基因的差异表达是寻找抗旱基因和培育抗旱品种的重要手段。抑制消减杂交是筛选差异表达基因的一种有效方法。为培育高抗旱性百脉根种质,本课题组经过多年研究筛选出高抗旱性百脉根种质B08,为了解B08百脉根种质抗旱机理、培育高抗旱性百脉根、挖掘相关抗旱基因、推广利用B08百脉根,本研究以B08百脉根叶片为材料,采用抑制消减杂交技术构建干旱胁迫下B08百脉根正反抑制消减文库,从正反文库中各随机挑选600个阳性克隆测序分析,筛选到了B08百脉根抗旱相关基因,再通过对这些基因所调控的抗旱相关植物激素、渗透性调节物质、叶绿素、抗氧化酶活性进行测定,得到以下结论:(1)成功构建了B08百脉根种质SSH c DNA文库。(2)正反文库各得到574条、595条高质量序列,正库序列平均长度为207.5 bp,反库序列平均长度为242.7 bp。使用Phred对测序得到的1 169条高质量序列数据进行组装,最终得到632条Unigene序列(又称独立基因),其中正向文库178条,反向文库454条。(3)用得到的632条Unigene分别与NCBI nt、NCBI nr、Swissport等数据库进行Blast比对,有147条基因注释成功,另外还发现了485条新基因。所得到的632条Unigene序列比对结果显示,这些基因大部分与百脉根基因组DNA1-6号染色体上的基因同源。(4)对NCBI nr注释结果进行物种统计,结果显示与毛果杨、苹果、菠菜、大麦、油菜等同源性较高。对正反库注释信息进行物种统计,这些基因中参与细胞及细胞器构成、结合活性、细胞代谢过程、催化作用的比例较大。(5)得到的Unigene涉及植物激素合成、能量代谢、光合作用、蛋白质代谢、离子转运、核酸代谢、信号转导等。(6)发现了与植物抗旱密切相关的吲哚-3-乙酸诱导蛋白ARG7(Indole-3-acetic acid-induced protein ARG7)、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(Serine/Threonine-protein phosphatase)、类钙调素蛋白(Calmodulin-like protein,CML)、丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)等。(7)ARG7基因差异表达的干旱处理组百脉根叶片脯氨酸、可溶性糖含量显著高于对照组(P0.05)。干旱第3 d、5 d、7 d各处理脯氨酸含量分别增加了7.9倍、8.1倍、8.4倍,增强了百脉根抗旱性。(8)类钙调素蛋白基因差异表达的干旱处理组百脉根叶片过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶活性显著提高(P0.05)。干旱第3 d、5 d、7 d各处理过氧化氢酶活性分别增加了4.1倍、1.9倍、4.0倍,过氧化物酶活性分别增加了3.7倍、5.4倍、4.6倍,超氧化物歧化酶活性分别增加了3.5倍、1.8倍、2.9倍,有利于清除百脉根叶片细胞中的活性氧,提高抗旱性。(9)干旱处理下,百脉根叶片叶绿素a叶绿素b,总叶绿素含量显著降低,第5d开始无显著变化。类钙调素蛋白基因差异表达的干旱处理组百脉根叶片中叶绿素a/b的值显著高于对照组。(10)丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶、ARG7基因差异表达的处理组百脉根叶片IAA、ABA含量显著增加(P0.05)。干旱第3 d、5 d、7 d各处理IAA含量分别增加了1.5倍、1.2倍、1.3倍,ABA含量分别增加了46.14%、53.34%、46.45%,增强了百脉根对干旱环境的适应性。
【学位单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S541.6
【部分图文】：

图 2.1 土壤相对含水量随时间变化Fig. 2.1 variation of soil relative water content with time2.3.2 叶片相对含水量随干旱时间的变化通过对干旱第 1 d、第 3 d、第 5 d、第 7 d、第 9 d 及对照组（CK）对含水量的测定分析可知，随着干旱时间的增加，叶片相对含水量逐渐下1 d 至第 5 d 叶片相对含水量下降缓慢，第 5 d 之后急剧下降，表明叶片水系统已崩溃。其中第 3 d 叶片相对含水量为 84.63 %，在 80 %-90 %范围内轻度干旱标准；第 5 d 叶片相对含水量为 77.82 %，在 65 %-80 %范围内，度干旱标准；第 7 d 叶片相对含水量为 53.79 %，在 50 %-65 %范围内，符干旱标准；第 9 d 时，叶片相对含水量仅为 38.28 %，接近永久枯死状态（

图 2.2 叶片相对含水量随时间变化Fig. 2.2 Variation of leaves relative water content with time2.3.3 植物形态随干旱时间变化根据图 2.3 可知，干旱胁迫处理及未干旱处理的 CK 对照组百脉根植如表 2.1：表 2.1 百脉根植物形态随干旱时间变化情况Table2.1 Lotus corniculatus of changes in plant morphology with drought time处理Treatment植物的形态The morphology of plants干旱程度Degree of drouCK 鲜嫩，长势良好 无干旱3 d 轻微萎蔫 轻度干旱5 d 萎蔫卷曲，但夜间能够恢复 中度干旱7 d 萎蔫卷曲，夜间不能恢复 重度干旱

图 2.3 干旱处理 3 d、5 d、7 d 及对照组百脉根形态Fig. 2.3 Plant morphology of Lotus corniculatus on the 3rd, 5th, and 7th day of drought treatment2.4 讨论干旱是一个全球性的问题，目前气温升高的形式下全球各地区干旱形式越来越严峻，研究和提高植物对干旱的适应能力，是一个需要长期持续的工作。干旱对植物的胁迫主要是对植物根的胁迫和对叶的胁迫，因此，在干旱试验中确定干旱胁迫程度必须结合根胁迫和叶胁迫状态来确定。学术界公认的根胁迫的参考指标为土壤相对含水量，但植物受到干旱胁迫后通常叶的水分变化最明显，结合叶片相对含水量和叶的形态变化可以更有效确定植物所受干旱胁迫程度，因此，使用叶片相对含水量和叶片形态变化作为干旱程度界定辅助指标已越来越普遍，而这种方式也更为合理地反应了植物地上部分和地下部分所受的胁迫程度，对植物所受胁迫状态的解释更为合理。干旱胁迫下百脉根 SSH 文库构建的目的是为了

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本文编号：2829035