新疆药用植物百里香内生放线菌的多样性与抗菌活性研究

发布时间：2020-10-09 00:30

　　叶霉病、枯萎病、果腐病等各类植物病害及其日益严重的抗药性严重影响寄主植物的优质高产,这种现状对新药的研发提出了更高的要求,迫使人们寻找抗动、植物病害及环境友好的新的天然生物活性物质。由于药用植物含有数量众多的具有抗菌、抗炎、促生等功能的有效化学成分,其内生放线菌存在于寄主植物各组织和器官内,长期以来与寄主形成了复杂且特殊的共生关系,并参与到植物生长的各个阶段,具备了产生与宿主植物相同或相似次生代谢产物的能力,因而在人类及动植物病害的生物防治方面起着重要的作用。伊犁塔城地区由于气候温和,雨量充沛,是新疆野生药材的最主要的分布区域。百里香作为多用途植物,不仅是保持干旱区水土的重要植被,而且植株全株及其精油在医药、化工等领域得到广泛应用。目前,国内外对百里香的研究,主要集中在百里香及其芳香油的化学成分、药理药效、临床应用及植物、食品保鲜等方面,关于其内生菌未见报道。本文以采自新疆伊犁、塔城的玫瑰百里香(Thymus roseus Schipcz.)作为材料,以其内生放线菌为研究对象,经过植物表面消毒处理后,应用三种植物预处理方法和10种分离培养基分离内生放线菌菌株。根据菌株的16S rRNA基因序列信息及其系统发育树来探讨药用植物内生放线菌的物种多样性,比较不同地理环境下的百里香内生放线菌组成及功能上的多样性,同时比较玫瑰百里香不同组织中内生放线菌的分布。另外对内生放线菌的抗病、产铁载体和几丁质酶能力以及抗生素生物合成酶基因的有无进行检测。研究结果显示,从玫瑰百里香分离到181株内生放线菌,通过比较三种植物预处理方法对内生放线菌出菌率的影响发现,-80℃冷冻处理的玫瑰百里香分离内生放线菌的效果最佳。结合-80℃冷冻处理法与腐殖酸维生素(HV)培养基分离内生放线菌,更能有效提高内生放线菌的出菌率。根据培养和形态特征在不同预处理间去重后得到的126株菌株(55株来自伊犁地区的百里香,71株来自塔城地区的百里香)构建基于16S rRNA基因序列的系统发育树,结果表明上述菌株分属于放线菌门的2个纲、8个目、14个科、24个属,玫瑰百里香T.roseus Schipcz内生放线菌多样性丰富。多样性参数值表明,生长在塔城地区的百里香内生放线菌物种组成比伊犁地区的丰富,然而主要优势属相同,均为链霉菌属。内生放线菌在玫瑰百里香不同组织部位的分布中,其在根部更为丰富,而且大多属于链霉菌属;大多数内生放线菌的分布具有普遍性外,部分菌株具有组织专一性。从玫瑰百里香分离到的126株内生放线菌对指示菌的抗菌活性结果显示,有54株菌株对一个或多个指示菌表现出了抑制能力。其中,菌株T4SB028(Streptomyces polyantibioticus)对Alternaria solani、Valsa malicola和Valsa mali的相对抑菌率分别高达67.06%、64.20%和70.55%。结果表明,玫瑰百里香内生放线菌具有抑菌广谱性,是苹果腐烂病菌、番茄早疫病菌以及肠炎沙门氏菌等病原菌的拮抗菌种库,而且大多数拮抗性菌株属于链霉菌属。在本次研究中,30.95%和23.01%的内生放线菌分别能产生铁载体和几丁质酶,与此同时,42.86%内生放线菌至少对一至九种供试病原菌表现出了不同程度的抑菌作用,可以看出,有些内生放线菌具有产生铁载体和几丁质酶能力的同时对供试病原菌具有抑制作用,有望研发成生物防治所需的微生物菌剂。另外,抗生素生物合成酶基因(PKS和NRPS)在百里香拮抗性内生放线菌中均有分布,其中PKS II的检出率相比其它两个基因的高,而且大多属于链霉菌属。百里香内生放线菌在野生药用植物百里香的保护中具有重要意义,并且为病害植株的优质高产提供了潜在的生防菌株,同时为人类及动物病害治疗有关的天然活性物质及新药的开发提供了理论依据。
【学位单位】：新疆大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S567;Q93
【部分图文】：

基本流程,表面消毒,消毒时间,消毒剂

图 1.1 植物内生放线菌分离的基本流程Fig.1.1 The basic isolation flow of plant endophytic actinomycetes生菌分离的关键之一是表面消毒。在对样品进行表面消毒以前首先行清洗，包括用流水冲洗和超声波清洗等以便去除植物样品表面免土壤微生物的干扰。对样品进行表面消毒时可以选用一些表面、Tween20、Tween80 等来降低表面张力，使消毒剂与植物表面得35]。对样品进行消毒时通常用乙醇，次氯酸钠或过氧化氢等消毒剂般样品的不同，导致消毒所需消毒剂的种类、浓度及消毒时间的用浓度为 70 % - 90 %的乙醇以及 1 % - 10 % 的次氯酸钠进行消毒以及植物组织不同，相应的消毒时间也就不同。一般木本植物所需于草本植物，根比茎与叶需要的消毒时间长。何判断分离到的微生物是内生菌，这就需要借助间接的检测方法—的有效性检测。主要包括三种方法：(1) 将表面消毒后的样品直接

新疆区域,划分图

图 1.2 新疆区域划分图Fig.1.2 Divided region of Xinjiang功能基因简介 PKS I 和 PKS II和非核糖体肽类均是天然产物中的两大家族。聚酮类化合物的(Polyketide synthase，PKS)催化而完成的。聚酮合酶分为三块型(PKS-I)、II 型又称芳香型(PKS-II)及 PKS-Ⅲ型又称查尔-I 主要由酮基合成酶(ketosynthase, KS)、烯酞还原酶(enoylred酶(aeyltransferase, AT)、酮基还原酶(ketoreducatase, KRase, DH)和酞基载体蛋白(aeylcamerprotein, ACP)等功能域组成“最小 PKS”是 KS、AT 和 ACP。在此延伸反应中，从 AT 选般为乙酸或丙酸)连接到链上，缩合反应由 KS 催化，接着 A

内生放线菌,百里香,培养基,不同部位

生放线菌种类和数量都有所不同。因此，本实验对百里香内生放线菌的分离方法进行了探索，比较不同培养基之间所分离内生放线菌的差异，从而找出内生放线菌分离的最适培养基，以此为百里香内生放线菌的分离提供一定的实验方法。本实验用 10 种分离培养基从伊犁、塔城两个地区的玫瑰百里香中共分离获得内生放线菌 181 株。图 2.1 显示了百里香在不同 10 种培养基中内生放线菌的分离情况，从中可以看出，M 7 号培养基分离到的内生放线菌数量最多，为 30株，其次为 M 5 (28 株)、M 6(26 株)、M 8(24)，然而从 M 3、M 4 号培养基中分离到的内生放线菌为数最少，分别为 6 和 7 株，这表明从不同的培养基分离出的放线菌数目具有较大差异。此外，图 2.1 比较了百里香不同部位内生放线菌的分离效果，可以看出，M 8 培养基从叶片分离到的内生放线菌数量相比其他培养基的多，因此可以认为百里香叶片内生放线菌的分离最适培养基为 M 8 培养基，然而分离百里香根、茎内生放线菌的最适培养基分别为 M 5，M 7 号培养基。

【参考文献】