基于转录组挖掘苦荞幼苗盐胁迫响应基因

发布时间：2020-11-01 23:31

　　 苦荞(Fagopyrum tataricum)是一种营养丰富的杂粮作物,种植苦荞不仅可以满足自身的食用需求,还可以带来可观的经济效益。随着土壤盐碱化的加重,苦荞的种植面临着很大的挑战,研究苦荞的耐盐机制,提高苦荞的耐盐性很有必要。本研究通过高通量测序平台Illumina Hiseq 2500对盐分处理后的苦荞幼苗进行高通量测序,进行转录组分析,对组装的Unigene进行功能注释,然后比对了苦荞对照样本与盐胁迫处理样本之间的转录本差异,以此确定苦荞参与盐胁迫响应的潜在调节因子,对深入了解苦荞耐盐网络的调控机制提供理论依据。主要研究结果如下:1.苦荞幼苗经过0.2 moL/L NaCl溶液胁迫处理24小时后,相对含水量由85.28%降低到了83.52%,表现为显著差异(0.01p0.05),相对电导率含量、丙二醛含量、SOD活性和POD活性分别提升了53.2%、25.9%、10%、40%,且都表现出极显著差异(p0.01)。2.对拼接好的Unigene进行功能注释,其中共有30500(52.65%)、21064(36.36%)、20859(36.01%)、11791(20.35%)、23445(40.47%)、11206(19.34%)和20834(35.96%)个Unigene分别注释到Genebank NR、Genebank NT、Pfam、KOG、Swiss-Prot、KEGG和GO数据库中。这些Unigene在GO数据库中划分到三大GO功能分类的56个GO亚类中,在KOG数据库比对划分到25个功能组中,KEGG分类则涉及到了273条代谢通路。3.预测了可能参与盐分应答的转录因子,鉴定出3107个Unigene,划分到93个转录因子家族中,占比最大的是C2H2、WD40-like以及MYB-HB-like家族。4.进行了差异表达基因分析,在455个差异表达基因中,404个Unigenes在盐分处理后表达上调,51个Unigene在盐分处理后表达下调。GO富集分析显示363个差异表达基因富集于25个GO亚类中,KEGG富集分析显示差异表达基因富集于抗原处理和呈现、内质网中蛋白质加工等代谢通路中。5.进行了SSR序列分析,共鉴定出6176个潜在的SSR,分布于5455个Unigene中,最丰富的重复类型是单核苷酸重复与三核苷酸重复,其中A/T序列重复出现的次数最多。6.随机挑选14个差异表达基因并设计引物进行荧光定量PCR,验证高通量测序结果,发现其表达趋势与转录组分析的结果基本一致,表明测序结果准确可靠。7.通过对差异表达基因进行同源分析,结合已报道的抗盐相关基因的研究,筛选出可能涉及苦荞盐分应答的62个基因,这些基因涉及蛋白激酶、磷酸酶、热休克蛋白、ABC转运蛋白、转移酶、非生物相关转录因子和生物钟的调控网络。
【学位单位】：成都大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S517
【部分图文】：

图 3.1 盐分胁迫对苦荞生理指标的影响Fig.3.1 Efferts of salt stress on physiological indicatorsin buckwheat注：A 代表相对水含量的变化，B 代表相对电导率的变化，C 代表丙二醛含量的变化，D 代表氧化物歧化酶的变化，E 代表过氧化物酶的变化。*代表差异显著（0.01<p<0.05），**代表差异极著（p<0.01）。对川荞一号幼苗在正常情况下生长以及在经过 0.2moL/L NaCl 溶液胁迫 24 小时后植株材料进行了取材，并测定与植物盐分胁迫响应相关的几个生理指标（图 3.1）。过对苦荞幼苗相对含水量的变化的测定，发现相对于对照的苦荞幼苗，处理后幼苗的对含水量显著降低，由 85.28%降低到了 86.52%，但都维持在 80%以上的较高水平。分胁迫后相对电导率由 4.7 % 增加至 7.2 %，盐分处理相对于对照提升了 53.2%，表出极显著的差异。在盐分处理后，苦荞幼苗中丙二醛含量由 21.8nmol·g-1FW 升高至.8nmol·g-1FW，相对增加了 25.9% ，并且表现出极显著差异，相应的，苦荞幼苗在盐胁迫响应中过氧化酶防御系统的活动也活跃了起来，其中超氧化物歧化酶的活性从正情况下 995.9U·g-1FW 增加到了 1058.1U·g-1FW，相对提升了 10%左右，过氧化物酶

成都大学硕士学位论文的变化更为明显，酶活性由 12.1U·min-1·g FW 提高到了 18.2U·min-1·g FW，增加了 40%左右，两种过氧化酶的活性提高均表现出了极显著差异。总的来说，在 0.2moL/L NaCl溶液处理 24 小时候后，苦荞幼苗的生理活动发生了明显的变化。3.2 总 RNA 质量鉴定将提取的总 RNA 通过 1%的琼脂糖凝胶电泳，结果出现了清晰的 28S、18S 和 5S条带（图 3.2），结果说明提取的苦荞 RNA 完整性较高，同时不存在自身基因组的污染，通过核酸浓度测定仪测定，对照以及盐分处理样本的 A260/A280 均在 1.8~2.1 范围内，RNA 中蛋白的污染可以容忍，A260/230 均在 2.1~2.5 范围内，说明有糖类、盐类、有机溶剂、等污染较少，提取的 RNA 可以进行下一步的转录组测序。

图 3.3 unigenes 长度分布图Fig.3.3 Length distribution of unigenesnigenes 功能注释nigenes 功能注释概况尽可能的注释组装得到的 Unigene 数据，将每个 Unigene 序列与 Geneban NT、Pfam、KOG、Swiss-Prot、KEGG 和 GO 数据库进行比对(表 3.3）。，在 57，921 个 Unigenes 中，有 30，500 个 Unigenes(占总 Unigenes 的 52ank NR 中被成功比对，在共 6 个公共数据库注释中，匹配度最高。在 Pf功比对 20，859 个 Unigenes(占总 Unigenes 的 36.01%)，Genebank NT 数据 21，064 个 Unigenes(占总 Unigenes 的 36.36%),SwissProt 数据库中成功比nigenes(占总 Unigenes 的 40.47%)。而通过使用 Blast2GO v2.5，我们发现nigenes(占总 Unigenes 的 35.96%)与 GO 数据库中的已知蛋白质成功比对。是 KEGG 和 KOG 数据库，共有 11，206 个 Unigenes(占总 Unigenes 的 19 数据库成功比对，11，791 个 Unigenes(占总 Unigenes 的 20.35%)与 KOG
【参考文献】

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本文编号：2866253