基于CHI基因多态性的甘草黄酮类化合物生物合成分子机制研究

发布时间：2020-11-02 20:50

　　 甘草为我国最常用的大宗药材之一,始载于《神农本草经》,被列为上品,具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药等作用,市场需求量巨大。《中华人民共和国药典》(2015版)明确规定:按干燥品计算,甘草中甘草苷(C21H2209)含量不得少于0.5%。但经课题组前期调查研究,市售甘草药材质量良莠不齐,存在大量甘草苷含量不达标样品。查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)为甘草苷生物合成途径中的第二个关键酶及限速酶,对于调控甘草中黄酮类化合物的积累具有重要意义。因此,本文围绕CHI基因展开研究,拟揭示甘草CHI基因多态性调控黄酮类化合物生物合成的分子机制,以期指导优质甘草的分子育种。本论文以60株甘草样品作为实验材料,首先利用HPLC法测定其4种主要黄酮类化合物(甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素)的含量,筛选出含量最高的6株及含量最低的5株甘草样品,作为后续基因分析的实验材料;利用RT-PCR法对11株黄酮高/低含量甘草样品进行CHI基因扩增,并对其进行多态性分析,筛选出黄酮高/低含量组样品CHI基因主流单倍型;利用生物信息学软件对主流CHI基因单倍型进行分析;构建重组毕赤酵母表达载体pPIC9K-CHI;利用电转法将重组后表达载体导入毕赤酵母GS115中;以甲醇为诱导剂对重组酵母工程菌G-P-CHI进行诱导表达,采用SDS-PAGE对表达产物进行检测;分别以异甘草素及柚皮素查尔酮为底物,以表达产物CHI为粗酶进行体外酶促反应,采用HPLC法对酶促反应产物进行定量分析。本论文取得的研究结果如下:(1)甘草CHI基因的克隆及多态性分析结果:11株黄酮高/低含量组样品中共计获得113条长度为690bp的CHI基因cDNA序列,编码229个氨基酸残基。经DNAMAN比对分析,113条CHI cDNA序列的一致性为99.64%,存在97个变异位点,可分为53种单倍型(单倍型1～53);113条CHI氨基酸序列的一致性为99.10%,存在63个变异位点,可分为44种氨基酸序列类型(AA-1～AA-44)。单倍型1～7为同义突变序列,编码AA-1;单倍型36～39为同义突变序列,编码AA-30。66条黄酮高含量组样品的CHI序列中,单倍型1数量为30,占比45.45%,为其主流单倍型;47条黄酮低含量组样品的CHI序列中,单倍型36数量为25,占比53.19%,为其主流单倍型。单倍型1与单倍型36仅在246bp处存在C/A颠换。(2)甘草黄酮高/低含量组CHI主流单倍型(单倍型1与单倍型36)的生物信息学分析结果:黄酮高含量组主流单倍型1与黄酮低含量组主流单倍型36所对应氨基酸序列类型AA-1与AA-30性质差异较小,仅在理化性质方面略有差异。二级结构功能元件及三级结构模板均一致,差异位点246bp位于底物结合区域外。AA-1与AA-30均不含信号肽、为查尔酮异构酶超家族成员、不含跨膜结构域、CHI蛋白位于膜外。与其他物种CHI序列的聚类分析结果表明AA-1与AA-30进化关系较近且与其他物种间区分良好。(3)转甘草特异性CHI基因毕赤酵母GS115工程菌的构建及表达分析:以pPIC9K为表达载体,构建了携带黄酮高含量组主流CHI基因型(单倍型1)的毕赤酵母GS115工程菌G-P-CHI-1及携带黄酮低含量组主流CHI基因型(单倍型36)的毕赤酵母GS115工程菌G-P-CHI-36,对其进行His+转化子筛选、遗传霉素G418筛选、Mut+型重组子筛选、PCR验证及测序验证后,利用甲醇对成功构建的工程菌进行诱导表达,利用SDS-PAGE对表达产物进行检测,得到与甘草CHI蛋白理论大小一致(24kDa)的产物,证明诱导表达成功。(4)CHI的体外酶促反应:分别以异甘草素及柚皮素查尔酮为酶促反应底物,以诱导表达得到的CHI蛋白为粗酶进行体外酶促反应。利用HPLC法对酶促反应后产物含量进行检测,结果表明诱导表达得到的CHI蛋白具有催化活性,且CHI-1的催化效率优于CHI-36,即黄酮高含量组主流单倍型的催化效率优于黄酮低含量组主流单倍型。
【学位单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S567.71
【部分图文】：

ｕｉｈｈ??圖??图１－１部分甘草总ＲＮＡ电泳图??注：１？４为＿ＲＮＡ样品，Ｍ为Ｍａｒｋｅｒ??３．２?ＰＣＲ扩增结果??以反转录获得的ｃＤＮＡ为模板，丨Ｆ与丨Ｒ为引物，ＰＣＲ扩增获得了长约６９０?ｂｐ的特??异条带，与目标基因长度一致，如图１－２所示。??图１－２部分甘草样品Ｃ／／／片段ＰＣＲ扩增结果??注：１？３为部分甘草样品的ＰＣＲ扩增产物，Ｍ为Ｍａｒｋｅｒ??将ＰＣＲ产物直接送测序，结果显示所得片段长度为６９０?ｂｐ，将该片段在ＮＣＢ丨的??ＧｅｎＢａｎｋ数据库中进行ＢＬＡＳＴ比对分析后发现，该片段与其他物种Ｃ／／／序列相似度较??高（图１－３），表明该序列为甘草ＣＷ／序列。??２９??

３．２?ＰＣＲ扩增结果??以反转录获得的ｃＤＮＡ为模板，丨Ｆ与丨Ｒ为引物，ＰＣＲ扩增获得了长约６９０?ｂｐ的特??异条带，与目标基因长度一致，如图１－２所示。??图１－２部分甘草样品Ｃ／／／片段ＰＣＲ扩增结果??注：１？３为部分甘草样品的ＰＣＲ扩增产物，Ｍ为Ｍａｒｋｅｒ??将ＰＣＲ产物直接送测序，结果显示所得片段长度为６９０?ｂｐ，将该片段在ＮＣＢ丨的??ＧｅｎＢａｎｋ数据库中进行ＢＬＡＳＴ比对分析后发现，该片段与其他物种Ｃ／／／序列相似度较??高（图１－３），表明该序列为甘草ＣＷ／序列。??２９??

３．３阳性克隆筛选结果??采用２．５中所述方法，对挑取的阳性克隆进行菌液ＰＣＲ验证，琼脂糖凝胶检测结果??如图１－４所示，绝大部分的阳性克隆均扩增得到目的基因条带。将ＰＣＲ扩增结果为阳性??的菌液送测序。??■ＷＰＷＵＬｂｐ??ｍｍｉ＇??图１－４部分菌液ＰＣＲ验证结果图??注：１？７为囷液样品，Ｍ为Ｍａｒｋｅｒ??３．４测序结果及分析??３．４．１甘草Ｃ／／／单倍型分析??１１株甘草样品共克隆得到１１３条Ｃ７／／基因ｃＤＮＡ序列，测序结果显示编码区全长??为６９０?ｂｐ；?ＤＮＡＭＡＮ比对分析显示１１３条序列中存在９７个变异位点，可分为５３种单??倍型
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本文编号：2867553