应用转录组与蛋白组挖掘冬虫夏草形成的关键位点及野生冬虫夏草与人工冬虫夏草蛋白组差异研究

发布时间：2020-11-07 10:41

　　 冬虫夏草Ophiocordyceps sinensis是麦角菌科冬虫夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体。具有“补肾益肺,止咳化痰”之功效,是一种名贵中药。由于其生理生化的特殊性和复杂性,目前其子实体形成机制研究得并不明确。本研究利用Illumina/Solexa HiSeq 2500反转录测序技术对冬虫夏草子实体、菌丝体及小金蝠蛾幼虫转录组进行测序、数据组装、分析,发现冬虫夏草菌丝体、子实体与冬虫夏草具有高同源性,而小金蝠蛾幼虫与其他样品的同源性很低;差异表达分析发现9238个基因在冬虫夏草菌丝体、子实体中均有表达,这相当于72.57%的重合度;经鉴定,1003个基因为DEGs(差异表达基因),KEGG富集分析显示这些DEGs富含核糖体途径;有161个差异表达基因参与丰富了GO术语。子实体中有58个差异表达基因下调,103个差异表达基因上调,表明冬虫夏草蛋白质合成的基本代谢在冬虫夏草菌感染小金蝠蛾幼虫后发生了改变,以及47个基因特异表达;还发现肌动蛋白和微管蛋白相关基因表达的改变可能在子实体发育中起作用。这些结果均与冬虫夏草子实体形成相关。同时利用2-DE(双向电泳)技术对冬虫夏草的发育过程中的三个阶段(菌虫复合体、子座、整体)的蛋白质组进行分析,筛选出5个稳定存在的蛋白质和3个具有显著差异的蛋白质,这8种蛋白质均在子座形成后出现。通过质谱技术进一步鉴定了这8个蛋白质,对其进行功能注释分析(GO、KEGG)后发现,3个具有显著差异的蛋白质斑点1、斑点5、斑点6均与细胞构成相关,其中斑点1参与大量核苷酸结合和酶活性过程,斑点5参与了大量代谢过程和化合物结合过程,斑点6参与了大量代谢过程和细胞生长过程;5个稳定存在的蛋白质中斑点2、斑点3与刺激应答、核苷三磷酸酶结合相关,斑点4与有机氮化合物代谢、离子结合相关,斑点7与生物调节和水解酶活性相关,斑点8与物质运输和转录合成相关。斑点1鉴定为肌动蛋白,GO注释发现该蛋白大量参与了细胞、细胞区域、细胞组分、细胞内、细胞内部分等过程,KEGG通路富集分析发现其活跃的代谢途径为磷脂酰肌醇信号系统、吞噬小体,提示肌动蛋白可能在冬虫夏草的生长发育中其重要作用。还通过2-DE(双向电泳)技术对野生冬虫夏草整体、菌虫复合体、子座及人工冬虫夏草整体、菌虫复合体、子座的蛋白质组进行对比分析,筛选出野生冬虫夏草特有的蛋白质,验证了课题组前期冬虫夏草正伪品指标性蛋白质,并基于蛋白质层面揭示了野生冬虫夏草与人工培育冬虫夏草间的差异,为后续野生冬虫夏草与人工冬虫夏草的鉴别研究奠定了基础。
【学位单位】：成都中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S567.35
【部分图文】：

53.3 差异表达和功能富集分析将冬虫夏草菌丝体组和子实体组的所有 RNA-Seq PE 读数分别与 O.sinensisCO18(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_000448365.1/)的基因组序列比对，并由 StringTie 组装。总共组装了 11264 个基因组编码基因和 233 个新基因。为了全面表征不同样品 RNA-Seq 的表达模式，将每个基因的比对读数的数量标准化，结果发现，9238 个基因在冬虫夏草菌丝体、子实体、小金蝠蛾幼虫及冬图 1.从冬虫夏草菌丝体和子实体获取的四个样本的 KOG 分类和表达分析 A：装配基因的 KOG 分类;B：六个样品 RNA-Seq 的主成分分析; C：表达转录本的维恩图。Figure. 1. KOG classification and expression analysis of four samples from mycelium and Fruiting body ofOphiocordyceps sinensis. A: KOG classification of assembly genes; B: principal component analysis ofRNA-seq in six samples; C: Venn diagram expressing transcripts.

GO 富集也证实了这一结果。DEGs 的主要 GO 术语包括大分子复合物（102 个基因），有机物质生物合成过程（88 个基因），生物合成过程（88 个基因），细胞生物合成过程（81 个基因）和有机氮化合物代谢过程（81 个基因），见图 2。DEGs 的富集分析发现剧烈变化的基因主要富集在核糖体的结构成分、核糖体亚基、蛋白酶体核心复合体、MCM 复合体、核糖核蛋白复合体途径。有 161 个差异表达基因参与丰富了 GO 术语。 子实体中有 58 个基因下调，另外 103 个基因上调。这些结果表明，冬虫夏草蛋白质合成的基本代谢在冬虫夏草菌感染小金蝠蛾幼虫后发生改变。分析发现冬虫夏草中还有 47 个基因特异表达（特异表达基因，SEG），包括非核糖体肽合成酶，细胞色素 P450，HSP70 家族伴侣，乙醛酸酶家族蛋白，细胞壁相关蛋白，乙醛酸酶家族蛋白和 推定的琥珀酰-CoA 连接酶编码基因。GO 分类结果表明，有 8 个特异表达基因与细胞部分相关。并且有 62 个基因在菌丝体中特异性表达，包括膜联蛋白，核糖体 RNA 加工蛋白 12 编码基因。

3.5 肌动蛋白和微管蛋白相关基因肌动蛋白基因(MSTRG.3317)的表达水平在冬虫夏草中平均表达丰度为 45.25，菌丝体组平均表达丰度为 155.24。微管蛋白/ FtsZ 蛋白编码基因(MSTRG.3823，MSTRG.689管蛋白/ FtsZ 家族蛋白(EQL01373.1)编码序列。子实体和菌平均表达水平分别为 1748.13 和 574.04。MSTRG.6894 为微基因表达从菌丝体组的 27.18 上调至子实体组的 78.95。表蛋白相关基因表达的改变可能在子实体发育中起作用。图 3 子实体发育候选基因的表达模式。根据 HemI 工具包的 log2FC 值绘制表达水平计算 CS 样品组和 HH 样品组之间的 Log2FC。Figure. 3.Expression patterns of candidate genes for fruiting body development.Heat maps are drawn based on the log2FC values of the HemI toolkit. The Log2set and the HH sample set was calculated based on the expression level of each g
【参考文献】

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本文编号：2873829