花生叶色突变体和AhPDS基因CRISPR-Cas9体系构建与遗传转化

发布时间：2021-05-10 05:52

　　花生是世界范围内广泛种植的重要油料作物,我国花生的年产量居世界首位,花生产业发展迅速,但是花生的基础理论研究进程明显滞后于其他作物。叶绿体是光合作用的重要场所,作为植物的能量转换站,在植物的生长发育中具有举足轻重的地位。叶色突变体可对光合效率产生一定影响,由于其表型特征明显,易于辨别而被应用于育种和分子标记辅助选择中。叶色突变体已在水稻等多种植物中得到研究和应用,但在花生中还未见报道。本研究从EMS诱变创建的花生突变体库中筛选出黄绿和白绿叶色突变体,并分析了其在不同发育时期生理指标的变化、细胞显微结构和产量差异;同时重点分析了八氢番茄红素脱氢酶（AhPDS）基因,对其理化性质和功能进行了预测,并构建了Ah20PDS基因的CRISPR-Cas9表达载体,利用农杆菌介导方法转入花生幼苗植株中,通过此技术对花生AhPDS基因实现定点敲除编辑,为进一步研究该基因功能和叶色表型分子育种奠定基础。本研究主要结果如下:（1）花生黄绿突变体和白绿突变体在不同发育时期叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素均比野生型有所降低,其中在苗期和盛花期叶绿素降低最为显著;叶绿素荧光动力学参数分析表明,主要参数Fv/Fm、... 

【文章来源】：河南农业大学河南省

【文章页数】：68 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
致谢
摘要
第一章 文献综述
    1.1 叶色突变体
        1.1.1 叶色突变体的分类
        1.1.2 叶绿体色素含量
        1.1.3 荧光动力学分析
        1.1.4 突变体叶绿体超微结构变化
        1.1.5 叶色突变体的应用前景
    1.2 类胡萝卜素简介
        1.2.1 类胡萝卜素的功能
        1.2.2 类胡萝卜素的生物合成途径
        1.2.3 类胡萝卜素合成过程中的主要酶
            1.2.3.1 八氢番茄红素合成酶(PSY)
            1.2.3.2 ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)
            1.2.3.3 番茄红素
            1.2.3.4 八氢番茄红素脱氢酶(PDS)
    1.3 Crispr cas9技术
    1.4 本研究的目的意义
第二章 叶色突变体农艺性状分析
    2.1 试验材料与方法
        2.1.1 试验材料
        2.1.2 材料的种植
    2.2 试验方法
        2.2.1 叶片色素含量的测定
        2.2.2 叶绿体超微结构的观察
            2.2.2.1 试剂的配制
            2.2.2.2 实验步骤
        2.2.3 叶片荧光动力学分析
        2.2.4 叶色突变体表型性状和产量性状的分析
        2.2.5 统计分析方法
    2.3 结果与分析
        2.3.1 叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量的分析
        2.3.2 不同叶色突变体的超微结构观察
        2.3.3 不同叶色突变体的叶绿素荧光参数分析
        2.3.4 不同叶色突变体的农艺性状及产量性状分析
    2.4 结论与讨论
第三章 花生AhPDS基因的克隆与分子特性分析
    3.1 实验材料
        3.1.1 供试材料
        3.1.2 菌株与质粒
        3.1.3 试剂耗材
        3.1.4 主要仪器和设备
        3.1.5 主要试剂的配制
    3.2 实验方法
        3.2.1 花生基因组DNA的提取
        3.2.2 花生总RNA的提取
        3.2.3 反转录合成cDNA
        3.2.4 花生AhPDS基因的克隆
            3.2.4.1 引物的设计与合成
            3.2.4.2 花生AhPDS的m RNA和 DNA全长序列的PCR扩增
            3.2.4.3 目的片段的纯化回收
            3.2.4.4 目的片段与PMD19-T载体的连接
            3.2.4.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
            3.2.4.6 目的基因的转化
            3.2.4.7 菌液PCR的检测
            3.2.4.8 花生AhPDS基因的生物信息学分析
    3.3 结果与分析
        3.3.1 花生AhPDS基因的克隆
        3.3.2 花生AhPDS基因编码蛋白质的生物信息学分析
            3.3.2.1 花生AhPDS基因的c DNA序列分析
            3.3.2.2 花生AhPDS基因编码的蛋白质序列分析
            3.3.2.3 花生AhPDS基因编码的蛋白质的翻译后修饰分析
            3.3.2.4 AhPDS蛋白的亚细胞定位
            3.3.2.5 花生AhPDS蛋白质的结构功能域预测
            3.3.2.6 花生AhPDS蛋白的同源性分析
    3.4 结论与讨论
第四章 花生AhPDS基因的CRISPR-CAS9 表达载体的构建与遗传转化
    4.1 试验材料
        4.1.1 供试材料
        4.1.2 菌株与质粒
        4.1.3 试剂耗材
        4.1.4 主要试剂的配置
        4.1.5 DNA测序
    4.2 试验方法
        4.2.1 总RNA的提取及c DNA的合成
        4.2.2 基因组DNA的提取
        4.2.3 CRISPR-Cas9 载体的构建
            4.2.3.1 CRISPR-Cas9 靶点选择
            4.2.3.2 花生AhPDS基因sgRNA靶位点序列引物的设计
            4.2.3.3 靶位点处寡聚核苷酸链片段及sgRNAcassette的At U6-26-sgRNA-SK载体的处理:
            4.2.3.4 sgRNA cassette的构建
            4.2.3.5 植物表达载体pCAMBIA1300-pYAO:Cas9 的构建
            4.2.3.6 构建好的sgRNA-Cas9载体转化到农杆菌载体LBA4404 中及验证
        4.2.4 农杆菌介导的转化
            4.2.4.1 农杆菌介导的花生转化
            4.2.4.2 转基因植株幼嫩叶片的PCR检测
    4.3 结果与分析
        4.3.1 花生AhPDS基因靶位点的查找及确定
        4.3.2 携带pds基因靶位点的sgRNA载体的鉴定
        4.3.3 sgRNA-Cas9载体的构建
        4.3.4 转基因植株叶片表型特征
    4.4 结论与讨论
参考文献
附录
Abstract



本文编号：3178811