甘蔗△ 1 -吡咯啉-5-羧酸合成酶基因（SoP5CS）的抗旱功能分析
发布时间：2021-05-16 11:35
甘蔗是重要的糖料和能源作物,也是很多工业产品的原料来源,但是中国的甘蔗80%以上种植在旱坡地上,缺乏灌溉条件,干旱己经成为制约我国甘蔗生产和蔗糖业发展的重要因素。基于此,我们在前人工作的基础上,从广西自育的抗旱性较强的桂糖21号（GT21）甘蔗品种中克隆了甘蔗△1-吡咯啉-5-竣酸合成酶基因（SoP5CS）,并对其序列特征进行了分析,通过荧光定量PCR分析了其在甘蔗不同组织及在不同处理下的表达特性;通过构建SoP5CS基因的原核表达载体,使目的蛋白在大肠杆菌中表达,蛋白经纯化后制备了单克隆抗体;通过构建基因的植物表达载体,遗传转化甘蔗和烟草进行过量表达研究。本研究希望通过综合研究SoP5CS的抗旱功能,为进一步利用该基因改良甘蔗及其他作物的抗旱性提供必要的研究基础和参考依据。本研究所获得的主要结果如下:1.运用RT-PCR技术,从GT21甘蔗叶片中克隆了 SoP5CS基因全长,获得了在NCBI上登陆号为KJ546350.1 的基因序列。该基因具有2151bp完整的开放阅读框,编码716个氨基酸,所编码的蛋白质分子量为77.72 kDa;是定位于内质网、不具有跨膜结构的亲水性蛋白。其核苷...
【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校
【文章页数】：112 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩写表
1 前言
1.1 干旱胁迫与植物的生理生化基础
1.1.1 干旱胁迫与植物抗氧化系统
1.1.2 干旱胁迫与植物渗透调节物质
1.1.3 干旱胁迫与植物细胞膜系统
1.1.4 干旱胁迫与植物内源激素
1.2 干旱胁迫与植物基因
1.2.1 干旱胁迫与植物基因的调控
1.2.2 植物干旱响应基因的挖掘
1.2.3 植物抗旱基因的功能研究
1.3 植物P5CS基因研究进展
1.3.1 植物P5CS基因的克隆与表达特性研究
1.3.2 植物P5CS基因在抗逆基因工程中的应用
1.4 甘蔗转基因研究进展
1.4.1 甘蔗遗传转化方法
1.4.2 甘蔗抗逆转基因研究
1.5 本研究的立论依据、研究目的及意义
1.6 本研究的技术路线
2 SoP5CS基因的克隆及序列分析
2.1 材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 菌种及载体
2.1.3 主要试剂
2.1.4 主要仪器设备
2.2 实验方法
2.2.1 甘蔗幼苗叶片总RNA的提取及检测
2.2.2 cDNA第一链的合成
2.2.3 引物设计和PCR扩增
2.2.4 目的条带的胶回收纯化
2.2.5 SoP5CS片段的连接及测序验证
2.2.6 生物信息学分析
2.3 结果分析
2.3.1 提取的总RNA质量检测
2.3.2 SoP5CS基因的扩增
2.3.3 SoP5CS基因的生物信息学相关分析
2.4 讨论
2.5 小结
3 SoP5CS基因表达量分析
3.1 材料
3.1.1 植物材料及处理
3.1.2 实验主要试剂
3.1.3 主要仪器设备
3.2 实验主要方法
3.2.1 RNA的提取及检测
3.2.2 基因组DNA的去除及cDNA的合成
3.2.3 SoP5CS基因荧光定量PCR引物的设计
3.2.4 荧光定量PCR
3.3 结果分析
3.3.1 RNA和cDNA质量的检测
3.3.2 SoP5CS的组织表达特性
3.3.3 SoP5CS在不同处理下的表达特性
3.4 讨论
3.5 本章小结
4 SoP5CS的原核表达、蛋白纯化及单克隆抗体制备
4.1 实验材料
4.1.1 载体及菌株
4.1.2 主要试剂
4.1.3 主要仪器设备
4.2 实验方法
4.2.1 pET-30a载体质粒的提取
4.2.2 目的基因与载体的双酶切
4.2.3 目的基因片段与原核表达载体的连接及转化
4.2.4 重组质粒pET30a-SoP5CS的提取及双酶切验证
4.2.5 重组质粒pET30a-SoP5CS转化BL21
4.2.6 融合蛋白的诱导表达
4.2.7 SDS-PAGE电泳
4.2.8 原核表达的SoP5CS蛋白的纯化
4.2.9 单克隆抗体的制备及鉴定
4.3 结果分析
4.3.1 原核表达载体的构建及验证
4.3.2 原核表达
4.3.3 原核表达蛋白的纯化
4.3.4 单克隆抗体的制备
4.4 讨论
4.5 小结
5 甘蔗过量表达SoP5CS基因的研究
5.1 材料
5.1.1 甘蔗材料
5.1.2 农杆菌及植物表达载体
5.1.3 主要试剂
5.1.4 培养基
5.1.5 主要的仪器设备
5.2 方法
5.2.1 植物表达载体引物的设计
5.2.2 SoP5CS基因ORF的扩增及回收
5.2.3 PUBTB质粒的提取
5.2.4 目的基因片段和载体质粒的双酶切及纯化
5.2.5 SoP5CS与植物表达载体的连接及转化
5.2.6 重组质粒的提取及酶切验证
5.2.7 重组质粒转化EHA105农杆菌
5.2.8 甘蔗组培材料的抗性筛选
5.2.9 甘蔗的遗传转化
5.2.10 转基因甘蔗基因组DNA的提取
5.2.11 转基因甘蔗的PCR检测
5.2.12 转基因甘蔗的抗旱研究
5.3 结果分析
5.3.1 植物表达载体的构建
5.3.2 PPT的抗性筛选
5.3.3 转基因甘蔗的获得
5.3.4 转基因甘蔗的PCR检测
5.3.5 转基因甘蔗的抗旱性鉴定
5.4 讨论
5.5 小结
6 SoP5CS基因转化烟草的研究
6.1 材料
6.1.1 烟草材料
6.1.2 菌种及载体
6.1.3 主要试剂
6.1.4 培养基
6.1.5 主要仪器设备
6.2 方法
6.2.1 烟草无菌苗的培养及烟草的遗传转化
6.2.2 转基因烟草DNA的提取
6.2.3 转基因烟草的PCR检测
6.2.4 转基因烟草的基因拷贝数测定
6.2.5 转基因烟草的抗旱性检测
6.3 结果与分析
6.3.1 转基因烟草的获得
6.3.2 转基因烟草的检测
6.3.3 转基因烟草的基因拷贝数测定
6.3.4 转基因烟草的抗旱性检测
6.4 讨论
6.5 小结
7 结论
7.1 全文结论
7.2 论文创新点
7.3 展望
参考文献
附录
致谢
攻读学位期间发表论文情况
【参考文献】：
期刊论文
[1]干旱胁迫对抗旱性蚕豆幼苗生长特性影响及叶片差异蛋白质组学研究[J]. 李萍,张雁霞,刘玉皎. 基因组学与应用生物学. 2017(01)
[2]高山离子芥CbPLDβ基因对转基因烟草抗寒性的影响[J]. 陈霞,李宜珅,仇奕之,陈璐,杨宁. 四川大学学报(自然科学版). 2016(05)
[3]铃铛刺苗期对持续干旱胁迫的生理响应[J]. 宋丹华,黄俊华,王丰,刘灿. 江苏农业科学. 2016(05)
[4]利用VIGS技术沉默GhBES1基因对棉花幼苗生理指标的影响[J]. 安汶铠,常丹,杨艺,张富春. 分子植物育种. 2016(03)
[5]基于转录组测序揭示适度干旱胁迫对甘草根基因表达的调控[J]. 张春荣,桑雪雨,渠萌,唐晓敏,程轩轩,潘利明,杨全. 中国中药杂志. 2015(24)
[6]赤霉素信号在非生物胁迫中的作用及其调控机制研究进展[J]. 牛亚利,赵芊,张肖晗,艾秋实,宋水山. 生物技术通报. 2015(10)
[7]棉花干旱诱导MYB类转录因子GhRAX3的功能分析[J]. 丁震乾,陈天子,刘廷利,刘小双,张保龙,周兴根. 中国农业科学. 2015(18)
[8]干旱胁迫对油桃细胞膜影响的研究[J]. 冯延辉. 安徽农学通报. 2015(14)
[9]转基因烟草中外源基因实时荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 王盛,谢芝勋,谢丽基,谢志勤,黄莉,罗思思,邓显文,黄娇玲,刘加波. 南方农业学报. 2015(05)
[10]棉花钠尿肽基因GhPNP1的耐旱功能分析[J]. 刘小双,刘廷利,袁洪波,张保龙,王荣富. 中国农业科学. 2015(12)
博士论文
[1]长期干旱条件下苹果水分利用效率调控的蛋白组学研究及相关基因鉴定[D]. 周莎莎.西北农林科技大学 2016
[2]苎麻转抗旱基因的功能评估及抗旱转录组研究[D]. 安霞.华中农业大学 2015
[3]玉米苗期抗旱品种筛选及抗旱生理与分子机制研究[D]. 田山君.四川农业大学 2014
[4]干旱对水稻花发育的影响：形态学，转录组学及相关基因的功能研究[D]. 金越.复旦大学 2013
[5]全基因组表达分析不同耐旱性水稻根系对不同强度干旱胁迫反应研究[D]. 马廷臣.华中农业大学 2009
[6]普通菜豆P5CS基因的克隆、功能验证及单核苷酸多态性[D]. 陈吉宝.中国农业科学院 2008
硕士论文
[1]甜菜病毒诱导基因沉默体系建立及抗旱基因功能验证[D]. 龚攀.哈尔滨工业大学 2015
[2]大豆WRKY、Exo70及其相关基因在抗旱性与生长发育中的功能[D]. 李桂平.浙江大学 2015
[3]GbMYB5基因在棉花耐干旱胁迫中的功能研究[D]. 李文娟.南京农业大学 2014
[4]甘蔗ATP-柠檬酸裂解酶基因（SoACLA-1）的克隆与功能分析[D]. 刘家仪.广西大学 2014
[5]RGD模体突变为KGD的突变体rLj-116与野生型rLj-RGD3的活性比较[D]. 王心.辽宁师范大学 2014
[6]根特异表达TaEXPB23提高转基因烟草和拟南芥的渗透胁迫耐性[D]. 李爱秀.山东农业大学 2013
[7]甘蔗铜/锌超氧化物歧化酶基因的克隆和功能分析[D]. 王盛.广西大学 2013
[8]虉草耐盐性鉴定及P5CS基因克隆[D]. 丛丽丽.四川农业大学 2012
[9]大豆凝集素基因lec-s的克隆及转化烟草的研究[D]. 郭佩佩.南京农业大学 2012
[10]二球悬铃木花发育相关基因功能的初步验证及遗传转化[D]. 易双双.华中农业大学 2010
本文编号：3189618
【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校
【文章页数】：112 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩写表
1 前言
1.1 干旱胁迫与植物的生理生化基础
1.1.1 干旱胁迫与植物抗氧化系统
1.1.2 干旱胁迫与植物渗透调节物质
1.1.3 干旱胁迫与植物细胞膜系统
1.1.4 干旱胁迫与植物内源激素
1.2 干旱胁迫与植物基因
1.2.1 干旱胁迫与植物基因的调控
1.2.2 植物干旱响应基因的挖掘
1.2.3 植物抗旱基因的功能研究
1.3 植物P5CS基因研究进展
1.3.1 植物P5CS基因的克隆与表达特性研究
1.3.2 植物P5CS基因在抗逆基因工程中的应用
1.4 甘蔗转基因研究进展
1.4.1 甘蔗遗传转化方法
1.4.2 甘蔗抗逆转基因研究
1.5 本研究的立论依据、研究目的及意义
1.6 本研究的技术路线
2 SoP5CS基因的克隆及序列分析
2.1 材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 菌种及载体
2.1.3 主要试剂
2.1.4 主要仪器设备
2.2 实验方法
2.2.1 甘蔗幼苗叶片总RNA的提取及检测
2.2.2 cDNA第一链的合成
2.2.3 引物设计和PCR扩增
2.2.4 目的条带的胶回收纯化
2.2.5 SoP5CS片段的连接及测序验证
2.2.6 生物信息学分析
2.3 结果分析
2.3.1 提取的总RNA质量检测
2.3.2 SoP5CS基因的扩增
2.3.3 SoP5CS基因的生物信息学相关分析
2.4 讨论
2.5 小结
3 SoP5CS基因表达量分析
3.1 材料
3.1.1 植物材料及处理
3.1.2 实验主要试剂
3.1.3 主要仪器设备
3.2 实验主要方法
3.2.1 RNA的提取及检测
3.2.2 基因组DNA的去除及cDNA的合成
3.2.3 SoP5CS基因荧光定量PCR引物的设计
3.2.4 荧光定量PCR
3.3 结果分析
3.3.1 RNA和cDNA质量的检测
3.3.2 SoP5CS的组织表达特性
3.3.3 SoP5CS在不同处理下的表达特性
3.4 讨论
3.5 本章小结
4 SoP5CS的原核表达、蛋白纯化及单克隆抗体制备
4.1 实验材料
4.1.1 载体及菌株
4.1.2 主要试剂
4.1.3 主要仪器设备
4.2 实验方法
4.2.1 pET-30a载体质粒的提取
4.2.2 目的基因与载体的双酶切
4.2.3 目的基因片段与原核表达载体的连接及转化
4.2.4 重组质粒pET30a-SoP5CS的提取及双酶切验证
4.2.5 重组质粒pET30a-SoP5CS转化BL21
4.2.6 融合蛋白的诱导表达
4.2.7 SDS-PAGE电泳
4.2.8 原核表达的SoP5CS蛋白的纯化
4.2.9 单克隆抗体的制备及鉴定
4.3 结果分析
4.3.1 原核表达载体的构建及验证
4.3.2 原核表达
4.3.3 原核表达蛋白的纯化
4.3.4 单克隆抗体的制备
4.4 讨论
4.5 小结
5 甘蔗过量表达SoP5CS基因的研究
5.1 材料
5.1.1 甘蔗材料
5.1.2 农杆菌及植物表达载体
5.1.3 主要试剂
5.1.4 培养基
5.1.5 主要的仪器设备
5.2 方法
5.2.1 植物表达载体引物的设计
5.2.2 SoP5CS基因ORF的扩增及回收
5.2.3 PUBTB质粒的提取
5.2.4 目的基因片段和载体质粒的双酶切及纯化
5.2.5 SoP5CS与植物表达载体的连接及转化
5.2.6 重组质粒的提取及酶切验证
5.2.7 重组质粒转化EHA105农杆菌
5.2.8 甘蔗组培材料的抗性筛选
5.2.9 甘蔗的遗传转化
5.2.10 转基因甘蔗基因组DNA的提取
5.2.11 转基因甘蔗的PCR检测
5.2.12 转基因甘蔗的抗旱研究
5.3 结果分析
5.3.1 植物表达载体的构建
5.3.2 PPT的抗性筛选
5.3.3 转基因甘蔗的获得
5.3.4 转基因甘蔗的PCR检测
5.3.5 转基因甘蔗的抗旱性鉴定
5.4 讨论
5.5 小结
6 SoP5CS基因转化烟草的研究
6.1 材料
6.1.1 烟草材料
6.1.2 菌种及载体
6.1.3 主要试剂
6.1.4 培养基
6.1.5 主要仪器设备
6.2 方法
6.2.1 烟草无菌苗的培养及烟草的遗传转化
6.2.2 转基因烟草DNA的提取
6.2.3 转基因烟草的PCR检测
6.2.4 转基因烟草的基因拷贝数测定
6.2.5 转基因烟草的抗旱性检测
6.3 结果与分析
6.3.1 转基因烟草的获得
6.3.2 转基因烟草的检测
6.3.3 转基因烟草的基因拷贝数测定
6.3.4 转基因烟草的抗旱性检测
6.4 讨论
6.5 小结
7 结论
7.1 全文结论
7.2 论文创新点
7.3 展望
参考文献
附录
致谢
攻读学位期间发表论文情况
【参考文献】：
期刊论文
[1]干旱胁迫对抗旱性蚕豆幼苗生长特性影响及叶片差异蛋白质组学研究[J]. 李萍,张雁霞,刘玉皎. 基因组学与应用生物学. 2017(01)
[2]高山离子芥CbPLDβ基因对转基因烟草抗寒性的影响[J]. 陈霞,李宜珅,仇奕之,陈璐,杨宁. 四川大学学报(自然科学版). 2016(05)
[3]铃铛刺苗期对持续干旱胁迫的生理响应[J]. 宋丹华,黄俊华,王丰,刘灿. 江苏农业科学. 2016(05)
[4]利用VIGS技术沉默GhBES1基因对棉花幼苗生理指标的影响[J]. 安汶铠,常丹,杨艺,张富春. 分子植物育种. 2016(03)
[5]基于转录组测序揭示适度干旱胁迫对甘草根基因表达的调控[J]. 张春荣,桑雪雨,渠萌,唐晓敏,程轩轩,潘利明,杨全. 中国中药杂志. 2015(24)
[6]赤霉素信号在非生物胁迫中的作用及其调控机制研究进展[J]. 牛亚利,赵芊,张肖晗,艾秋实,宋水山. 生物技术通报. 2015(10)
[7]棉花干旱诱导MYB类转录因子GhRAX3的功能分析[J]. 丁震乾,陈天子,刘廷利,刘小双,张保龙,周兴根. 中国农业科学. 2015(18)
[8]干旱胁迫对油桃细胞膜影响的研究[J]. 冯延辉. 安徽农学通报. 2015(14)
[9]转基因烟草中外源基因实时荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 王盛,谢芝勋,谢丽基,谢志勤,黄莉,罗思思,邓显文,黄娇玲,刘加波. 南方农业学报. 2015(05)
[10]棉花钠尿肽基因GhPNP1的耐旱功能分析[J]. 刘小双,刘廷利,袁洪波,张保龙,王荣富. 中国农业科学. 2015(12)
博士论文
[1]长期干旱条件下苹果水分利用效率调控的蛋白组学研究及相关基因鉴定[D]. 周莎莎.西北农林科技大学 2016
[2]苎麻转抗旱基因的功能评估及抗旱转录组研究[D]. 安霞.华中农业大学 2015
[3]玉米苗期抗旱品种筛选及抗旱生理与分子机制研究[D]. 田山君.四川农业大学 2014
[4]干旱对水稻花发育的影响：形态学，转录组学及相关基因的功能研究[D]. 金越.复旦大学 2013
[5]全基因组表达分析不同耐旱性水稻根系对不同强度干旱胁迫反应研究[D]. 马廷臣.华中农业大学 2009
[6]普通菜豆P5CS基因的克隆、功能验证及单核苷酸多态性[D]. 陈吉宝.中国农业科学院 2008
硕士论文
[1]甜菜病毒诱导基因沉默体系建立及抗旱基因功能验证[D]. 龚攀.哈尔滨工业大学 2015
[2]大豆WRKY、Exo70及其相关基因在抗旱性与生长发育中的功能[D]. 李桂平.浙江大学 2015
[3]GbMYB5基因在棉花耐干旱胁迫中的功能研究[D]. 李文娟.南京农业大学 2014
[4]甘蔗ATP-柠檬酸裂解酶基因（SoACLA-1）的克隆与功能分析[D]. 刘家仪.广西大学 2014
[5]RGD模体突变为KGD的突变体rLj-116与野生型rLj-RGD3的活性比较[D]. 王心.辽宁师范大学 2014
[6]根特异表达TaEXPB23提高转基因烟草和拟南芥的渗透胁迫耐性[D]. 李爱秀.山东农业大学 2013
[7]甘蔗铜/锌超氧化物歧化酶基因的克隆和功能分析[D]. 王盛.广西大学 2013
[8]虉草耐盐性鉴定及P5CS基因克隆[D]. 丛丽丽.四川农业大学 2012
[9]大豆凝集素基因lec-s的克隆及转化烟草的研究[D]. 郭佩佩.南京农业大学 2012
[10]二球悬铃木花发育相关基因功能的初步验证及遗传转化[D]. 易双双.华中农业大学 2010
本文编号：3189618
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