烟草Shaker钾通道NsylNKT6和NtomSKOR1在钾素吸收转运过程中的功能研究
发布时间：2021-07-08 22:54
烟草是典型的喜钾作物。钾不仅从多个方面参与烟草的生长发育,还作为重要的品质元素,调节烟草的生理生化反应,影响烟叶的品质、燃烧性和烟制品的安全性。烟草对K+的吸收主要由钾通道和钾转运体介导。Shaker家族钾通道是研究最早、最为深入的一类钾通道。挖掘烟草关键Shaker钾通道基因,解析其在钾素营养过程中的功能和调控机制,对烟草的高钾遗传改良具有重要意义。本研究分别以林烟草（Nicotiana sylvestris）Shaker钾通道NsylNKT6和绒毛状烟草（N.tomentosiformis）Shaker钾通道NtomSKOR1为研究对象,通过生物信息学分析、组织化学染色和过表达材料的表型鉴定等试验,对两个基因在钾吸收转运方面的功能进行初步探究。为明确NsylNKT6的组织表达模式,对该基因启动子序列进行了顺式作用元件预测。结果表明,NsylNKT6启动子含有光响应元件、植物激素响应元件（脱落酸、乙烯和赤霉素等）、胁迫响应元件（厌氧、干旱、抗病和伤口等）和分生组织表达元件等,推测该基因的表达可能受到光、激素和胁迫等多种环境信号的调控。进一步获得了NsylNKT6...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
植物Shaker钾通道的结构（LEBAUDYetal.,2007）
抑制，但其具体功能尚不清楚（靳义荣 等，2013a）1602-1611。在此基础上，本部分工作通过启动子融合 GUS 报告基因明确 NsylNKT6 的组织表达；重新克隆 NsylNKT6 编码区，结合酵母异源表达试验确定其是否具有钾吸收功能；筛选获得过表达 NsylNKT6 的拟南芥和烟草纯合材料，对其进行表型观察和钾含量测定。通过以上研究，解析 NsylNKT6 在钾吸收转运方面的功能。 3.1 NsylNKT6 启动子的克隆及其活性分析 3.1.1 NsylNKT6 启动子的顺式作用元件预测 本课题组前期以林烟草基因组 DNA 为模板，通过基因特异性引物扩增，获得了长度为 1981 bp 的 NsylNKT6 启动子序列（靳义荣，2013b; 图 3-1，附录 C），该启动子序列位于 NsylNKT6 起始密码子 ATG 上游-20~-2000 bp 处（以 ATG 的 A 碱基处设定为 1）。将该片段连入 pMD19-T 后获得 pMD19-T-NsylNKT6pro 质粒。
中国农业科学院硕士学位论文第三章林烟草NsylNKT6参与植物钾吸收转运的功能分析173.1.2林烟草ProNsylNKT6::GUS转基因植株的获得以pMD19-T-NsylNKT6pro质粒为模板，经PCR在NsylNKT6启动子两端分别引入XbaⅠ和SmaⅠ酶切位点及相应保护碱基，经酶切后连入pBI101相应酶切位点，获得NsylNKT6启动子驱动GUS的表达载体pBI101-NsylNKT6pro。采用叶盘转化法将ProNsylNKT6::GUS片段转入林烟草，获得T0代植株。基因组PCR检测结果显示（图3-3），7份T0代材料（编号1、2、4、5、6、8、9）为转基因阳性材料。收获上述材料的严格自交种T1代，经平板抗性筛选后，所获阳性株用于后续GUS组织化学染色。图3-3林烟草ProNsylNKT6::GUS转基因植株的基因组PCR阳性鉴定Fig.3-3GenomicidentificationofProNsylNKT6::GUStransgenicN.sylvestris注：M：DNAMarkerDL1000；+：阳性对照（阳性质粒）；-：阴性对照（野生型林烟草）；1-9：T0代植株编号；下划线编号表示阳性植株。Note:M:DNAMarkerDL1000;+:thepositivecontrol;-:thenegativecontrol(N.Sylvestris);1-9:plantnumbersofT0generation;underlinednumbersmeanpositiveplants.3.1.3转ProNsylNKT6::GUS林烟草材料的GUS组织化学染色在出苗期（种子萌发后7d）和团棵期（种子萌发后60d），选取正常培养条件下的转ProNsylNKT6::GUS林烟草材料，进行GUS组织化学染色。结果表明，种子萌发7d时，在叶片的保卫细胞检测到明显的GUS活性，在叶片的其他组织和根部均未检测到GUS活性（图3-4）。图3-4种子萌发后7dProNsylNKT6::GUS转基因林烟草的GUS染色结果Fig.3-4GUSstainingresultsofProNsylNKT6::GUStransgenicN.sylvestris7daftergermination注：A、B：叶；C、D：根；所有染色结果来自种子萌发后7d的转基因林烟草幼苗；比例尺
本文编号：3272487
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
植物Shaker钾通道的结构（LEBAUDYetal.,2007）
抑制，但其具体功能尚不清楚（靳义荣 等，2013a）1602-1611。在此基础上，本部分工作通过启动子融合 GUS 报告基因明确 NsylNKT6 的组织表达；重新克隆 NsylNKT6 编码区，结合酵母异源表达试验确定其是否具有钾吸收功能；筛选获得过表达 NsylNKT6 的拟南芥和烟草纯合材料，对其进行表型观察和钾含量测定。通过以上研究，解析 NsylNKT6 在钾吸收转运方面的功能。 3.1 NsylNKT6 启动子的克隆及其活性分析 3.1.1 NsylNKT6 启动子的顺式作用元件预测 本课题组前期以林烟草基因组 DNA 为模板，通过基因特异性引物扩增，获得了长度为 1981 bp 的 NsylNKT6 启动子序列（靳义荣，2013b; 图 3-1，附录 C），该启动子序列位于 NsylNKT6 起始密码子 ATG 上游-20~-2000 bp 处（以 ATG 的 A 碱基处设定为 1）。将该片段连入 pMD19-T 后获得 pMD19-T-NsylNKT6pro 质粒。
中国农业科学院硕士学位论文第三章林烟草NsylNKT6参与植物钾吸收转运的功能分析173.1.2林烟草ProNsylNKT6::GUS转基因植株的获得以pMD19-T-NsylNKT6pro质粒为模板，经PCR在NsylNKT6启动子两端分别引入XbaⅠ和SmaⅠ酶切位点及相应保护碱基，经酶切后连入pBI101相应酶切位点，获得NsylNKT6启动子驱动GUS的表达载体pBI101-NsylNKT6pro。采用叶盘转化法将ProNsylNKT6::GUS片段转入林烟草，获得T0代植株。基因组PCR检测结果显示（图3-3），7份T0代材料（编号1、2、4、5、6、8、9）为转基因阳性材料。收获上述材料的严格自交种T1代，经平板抗性筛选后，所获阳性株用于后续GUS组织化学染色。图3-3林烟草ProNsylNKT6::GUS转基因植株的基因组PCR阳性鉴定Fig.3-3GenomicidentificationofProNsylNKT6::GUStransgenicN.sylvestris注：M：DNAMarkerDL1000；+：阳性对照（阳性质粒）；-：阴性对照（野生型林烟草）；1-9：T0代植株编号；下划线编号表示阳性植株。Note:M:DNAMarkerDL1000;+:thepositivecontrol;-:thenegativecontrol(N.Sylvestris);1-9:plantnumbersofT0generation;underlinednumbersmeanpositiveplants.3.1.3转ProNsylNKT6::GUS林烟草材料的GUS组织化学染色在出苗期（种子萌发后7d）和团棵期（种子萌发后60d），选取正常培养条件下的转ProNsylNKT6::GUS林烟草材料，进行GUS组织化学染色。结果表明，种子萌发7d时，在叶片的保卫细胞检测到明显的GUS活性，在叶片的其他组织和根部均未检测到GUS活性（图3-4）。图3-4种子萌发后7dProNsylNKT6::GUS转基因林烟草的GUS染色结果Fig.3-4GUSstainingresultsofProNsylNKT6::GUStransgenicN.sylvestris7daftergermination注：A、B：叶；C、D：根；所有染色结果来自种子萌发后7d的转基因林烟草幼苗；比例尺
本文编号：3272487
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