小麦细胞周期调控基因TaCDC48的克隆和功能分析
发布时间：2021-08-04 01:01
细胞周期活动是生物体最基本的生理活动之一,细胞周期调控因子（CDC48）通过激活周期蛋白依赖激酶（CDK）参与调控细胞分裂。细胞分裂活动的重启与植物体细胞胚胎发生能力的获得和愈伤组织脱分化状态的维持密切相关。本研究以小麦品种科农199（KN199）为材料,通过同源比对克隆得到小麦的细胞周期调控基因TaCDC48,通过对TaCDC48进行分子生物学分析以及转基因功能鉴定,以期进一步明确细胞周期调控基因对体细胞胚胎发生的影响,以及TaCDC48在提高植物细胞分裂效率方面的作用。主要研究结果如下:1、小麦TaCDC48基因的克隆及表达特性分析。利用同源比对技术克隆得到小麦TaCDC48基因,TaCDC48在小麦生长旺盛的幼穗及胚性愈伤中的表达量高于其他组织,且能够在小麦愈伤组织诱导和分化的早期阶段响应表达。2、TaCDC48和TaSERK1蛋白的互作验证。同时利用酵母双杂交技术和双分子荧光互补技术证明了TaCDC48和TaSERK1的互作关系,二者在细胞质中发生互作,暗示,TaCDC48可能通过与TaSERK1蛋白的相互作用,以形成复合物形式参与植物体细胞胚胎发生过程。3、TaCDC48转基...
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CDC48蛋白的结构示意图
8小麦细胞周期调控基因TaCDC48的克隆和功能分析1.6选题的目的和意义小麦（Triticumaestivum)是我国重要的粮食作物之一，分子育种和转基因技术育种为小麦育种提供了新的研究方向。目前，人们已经能够利用小麦的花药(Hanetal.2010)、幼胚、成熟胚(zgenetal.1998)等外植体获得再生植株。但是不同基因型的小麦体外培养往往在胚性愈伤组织的诱导、分化等方面表现出较大差异。研究发现，植物组织脱分化与细胞周期的重建相关，细胞重新进入分裂状态标志着细胞脱分化的开始，细胞脱分化状态的维持和胚胎发生离不开活跃的细胞分裂(Grafi2004)。因此研究小麦体细胞胚胎发生过程中的细胞周期调控对于完善小麦体细胞胚胎发生的作用机制进而提高小麦组织培养的再生率具有一定意义。细胞周期调控是生物体重要的生理活动，而CDC48又是细胞周期调节关键基因，目前仅在拟南芥、水稻、龙眼等少数几种植物中克隆到该基因，在小麦中尚未见该基因报道。本研究通过对小麦细胞周期调控基因（TaCDC48）的克隆及分子特性分析，并通过验证其与小麦体细胞胚胎发生受体类激酶基因（TaSERK1）的互作关系，为进一步明确小麦TaCDC48基因的功能及其参与小麦体细胞胚胎发生过程的分子机制提供参考。1.7技术路线图1-2技术路线
20小麦细胞周期调控基因TaCDC48的克隆和功能分析第三章结果与分析3.1TaCDC48基因的克隆根据NCBI和EnsemblPlant数据库中小麦基因组数据，得到小麦细胞周期调控基因的候选序列TaCDC48，以KN199小麦cDNA为模板，以TaCDC48F和TaCDC48R为引物，扩增得到如图3-1所示条带。经测序分析显示该条带为小麦细胞周期调控基因TaCDC48的cDNA序列。利用NCBI数据库的ORFFinder预测显示TaCDC48为完整的ORF(openreadingframe)。序列分析结果表明，TaCDC48由2442个碱基组成，编码813个氨基酸，分子量为85kD，等电点为5.15，预测显示，TaCDC48的gDNA序列包含10个外显子和9个内含子。图3-1：TaCDC48基因克拢M：SuperMaker；1：目标条带。Figure3-1:CloningofTaCDC48gene.M:SuperMarker;1:Thetargetgene.3.2生物信息学分析对不同物种间细胞周期调控蛋白（CDC48）的进化关系分析，结果显示，在进化关系上，普通小麦的细胞周期调控蛋白与乌拉尔图小麦的细胞周期调控蛋白亲缘关系最近，除此之外禾本科之间的细胞周期调控蛋白亲缘关系都较近（图3-2B）。在Phyre网站(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)预测TaCDC48蛋白三级结构如图3-2A。根据DNAMAN的序列比对结果，可以看出细胞周期调控蛋白是生物体内高度保守的蛋白（图3-4）。利用DOG2.0软件对13个物种的细胞周期调控蛋白进行结构域预测，发现不同物种间细胞周期调控蛋白都含有一个N端结构域、一个CDC48结构域、两个高度保守的ATP酶结构域D1和D2，但C端结构域表现不同，与小麦亲缘关系最近的乌拉尔图小麦细胞周期调控蛋白CDC48含有C端结构域，而在普通小麦中却不含有C端结构域（图3-3）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]酵母双杂交技术及应用的研究进展[J]. 郑立双,李向楠,孙城涛,刘红羽,刘勋,贺明,吕文发. 中国畜牧兽医. 2013(09)
[2]流式细胞仪在植物科学领域中的应用及方法举例[J]. 黄秀清,郭伟志,马志慧,任艳,张幸幸,黄小丹,丁国昌. 安徽农学通报. 2013(11)
[3]利用流式细胞仪研究拟南芥叶发育过程中细胞周期的调控[J]. 曾民环,许德阳,薛景石,袁振环,黄海,崔晓峰. 植物生理学报. 2012(09)
[4]植物体细胞胚胎发生受体类蛋白激酶的生物学功能[J]. 石雅丽,张锐,林芹,郭三堆. 遗传. 2012(05)
[5]双分子荧光互补技术[J]. 樊晋宇,崔宗强,张先恩. 中国生物化学与分子生物学报. 2008(08)
[6]高等植物体细胞胚胎发生的研究进展[J]. 周键,孙建波,彭明. 中国农学通报. 2008(02)
[7]Isolation, characterization and functional analysis of a cdc48 homologue from tobacco BY-2 cells[J]. CHEN Zhiling, YU Yi, LIU Lina and XIA Guixian ( College of Life Science, Capital Normal University, Beijing 100037, China; Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100080, China). Progress in Natural Science. 2007(02)
[8]小麦体细胞胚发生中DNA、RNA和蛋白质的合成动态[J]. 崔凯荣,王晓哲,陈雄,王亚馥. 核农学报. 1997(04)
博士论文
[1]小麦组织培养再生相关基因克隆及分子特性分析[D]. 佘茂云.中国农业科学院 2011
硕士论文
[1]烟草细胞周期相关基因NtCDC48的克隆与功能研究[D]. 刘丽娜.首都师范大学 2006
本文编号：3320675
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CDC48蛋白的结构示意图
8小麦细胞周期调控基因TaCDC48的克隆和功能分析1.6选题的目的和意义小麦（Triticumaestivum)是我国重要的粮食作物之一，分子育种和转基因技术育种为小麦育种提供了新的研究方向。目前，人们已经能够利用小麦的花药(Hanetal.2010)、幼胚、成熟胚(zgenetal.1998)等外植体获得再生植株。但是不同基因型的小麦体外培养往往在胚性愈伤组织的诱导、分化等方面表现出较大差异。研究发现，植物组织脱分化与细胞周期的重建相关，细胞重新进入分裂状态标志着细胞脱分化的开始，细胞脱分化状态的维持和胚胎发生离不开活跃的细胞分裂(Grafi2004)。因此研究小麦体细胞胚胎发生过程中的细胞周期调控对于完善小麦体细胞胚胎发生的作用机制进而提高小麦组织培养的再生率具有一定意义。细胞周期调控是生物体重要的生理活动，而CDC48又是细胞周期调节关键基因，目前仅在拟南芥、水稻、龙眼等少数几种植物中克隆到该基因，在小麦中尚未见该基因报道。本研究通过对小麦细胞周期调控基因（TaCDC48）的克隆及分子特性分析，并通过验证其与小麦体细胞胚胎发生受体类激酶基因（TaSERK1）的互作关系，为进一步明确小麦TaCDC48基因的功能及其参与小麦体细胞胚胎发生过程的分子机制提供参考。1.7技术路线图1-2技术路线
20小麦细胞周期调控基因TaCDC48的克隆和功能分析第三章结果与分析3.1TaCDC48基因的克隆根据NCBI和EnsemblPlant数据库中小麦基因组数据，得到小麦细胞周期调控基因的候选序列TaCDC48，以KN199小麦cDNA为模板，以TaCDC48F和TaCDC48R为引物，扩增得到如图3-1所示条带。经测序分析显示该条带为小麦细胞周期调控基因TaCDC48的cDNA序列。利用NCBI数据库的ORFFinder预测显示TaCDC48为完整的ORF(openreadingframe)。序列分析结果表明，TaCDC48由2442个碱基组成，编码813个氨基酸，分子量为85kD，等电点为5.15，预测显示，TaCDC48的gDNA序列包含10个外显子和9个内含子。图3-1：TaCDC48基因克拢M：SuperMaker；1：目标条带。Figure3-1:CloningofTaCDC48gene.M:SuperMarker;1:Thetargetgene.3.2生物信息学分析对不同物种间细胞周期调控蛋白（CDC48）的进化关系分析，结果显示，在进化关系上，普通小麦的细胞周期调控蛋白与乌拉尔图小麦的细胞周期调控蛋白亲缘关系最近，除此之外禾本科之间的细胞周期调控蛋白亲缘关系都较近（图3-2B）。在Phyre网站(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)预测TaCDC48蛋白三级结构如图3-2A。根据DNAMAN的序列比对结果，可以看出细胞周期调控蛋白是生物体内高度保守的蛋白（图3-4）。利用DOG2.0软件对13个物种的细胞周期调控蛋白进行结构域预测，发现不同物种间细胞周期调控蛋白都含有一个N端结构域、一个CDC48结构域、两个高度保守的ATP酶结构域D1和D2，但C端结构域表现不同，与小麦亲缘关系最近的乌拉尔图小麦细胞周期调控蛋白CDC48含有C端结构域，而在普通小麦中却不含有C端结构域（图3-3）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]酵母双杂交技术及应用的研究进展[J]. 郑立双,李向楠,孙城涛,刘红羽,刘勋,贺明,吕文发. 中国畜牧兽医. 2013(09)
[2]流式细胞仪在植物科学领域中的应用及方法举例[J]. 黄秀清,郭伟志,马志慧,任艳,张幸幸,黄小丹,丁国昌. 安徽农学通报. 2013(11)
[3]利用流式细胞仪研究拟南芥叶发育过程中细胞周期的调控[J]. 曾民环,许德阳,薛景石,袁振环,黄海,崔晓峰. 植物生理学报. 2012(09)
[4]植物体细胞胚胎发生受体类蛋白激酶的生物学功能[J]. 石雅丽,张锐,林芹,郭三堆. 遗传. 2012(05)
[5]双分子荧光互补技术[J]. 樊晋宇,崔宗强,张先恩. 中国生物化学与分子生物学报. 2008(08)
[6]高等植物体细胞胚胎发生的研究进展[J]. 周键,孙建波,彭明. 中国农学通报. 2008(02)
[7]Isolation, characterization and functional analysis of a cdc48 homologue from tobacco BY-2 cells[J]. CHEN Zhiling, YU Yi, LIU Lina and XIA Guixian ( College of Life Science, Capital Normal University, Beijing 100037, China; Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100080, China). Progress in Natural Science. 2007(02)
[8]小麦体细胞胚发生中DNA、RNA和蛋白质的合成动态[J]. 崔凯荣,王晓哲,陈雄,王亚馥. 核农学报. 1997(04)
博士论文
[1]小麦组织培养再生相关基因克隆及分子特性分析[D]. 佘茂云.中国农业科学院 2011
硕士论文
[1]烟草细胞周期相关基因NtCDC48的克隆与功能研究[D]. 刘丽娜.首都师范大学 2006
本文编号：3320675
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