小麦旗叶高表达的tae-miR9663和tae-miR5062功能的初步研究
发布时间：2021-08-12 19:40
miRNA参与调控植物生长发育、生物或非生物胁迫等多种生物学过程,并发挥重要作用。近年来,通过高通量测序已鉴定筛选出大量的小麦miRNA,但其生物学功能是未知的。tae-miR9663和tae-miR5062是本实验室前期鉴定出的新miRNA,它们在小麦幼苗、旗叶和发育的籽粒中都表达,尤其在旗叶中高表达。为了探索它们的功能,本研究通过克隆得到tae-miR9663和tae-miR5062的前体,通过人工合成得到tae-miR9663和tae-miR5062的小串联模拟靶标（short tandem target mimic,STTM）,将它们分别构建到大麦条斑花叶病毒（barley stripe mosaic virus,BSMV）载体上,获得重组病毒载体BSMV:tae-miR9663、BSMV:STTM9663、BSMV:tae-miR5062和BSMV:STTM5062;利用这些重组病毒分别接种宁春16小麦第35片叶,在小麦叶片瞬时过表达或沉默目标miRNA,观察侵染植株表型变化,并实时定量qRT-PCR检测目标miRNA及其靶基因的丰度变化,探索miRNA...
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
采用颈环引物反转录PCR的原理
4小麦旗叶高表达的tae-miR9663和tae-miR5062功能的初步研究加尾法是先在miRNA的3′末端加入poly（A）尾，然后加入含接头序列的poly（T）进行逆转录反应，获得有接头的cDNA第一链，为后续PCR反应提供反向通用引物的序列，再利用miRNA特异性引物作为正向引物便可PCR扩增（ShiandChiang2005）（图1-2）。此法也可用SYBRGreen染料定量检测miRNA。Xue等（2009）使用这种方法分析了水稻籽粒相关的小RNA，鉴定出26个新的miRNA和12个候选miRNA。Yang等（2011）用此方法对高通量测序结果进行验证，比较了地黄中89个保守的miRNA和6个新的miRNA。图1-2采用加尾法进行qRT-PCR的原理Fig.1-2SchematicdescriptionofpolyAqRT-PCR1.1.3植物miRNA靶基因的预测及其实验验证miRNA通过调控其靶基因来发挥生物学功能，因此要研究miRNA的功能，首先要进行靶基因的鉴定。由于miRNA数量多，利用传统的方法筛选靶基因效率很低，因而生物信息学技术成为预测靶基因的首要方法。结合植物miRNA和其靶基因高度匹配的特点，已有很多预测的软件被设计出来，比如BLAST、miRU、psRNATarget以及PatScan等（易小娅等2015）。Barozai等（2012）通过序列比对和RNA-hybrid（Rehmsmeieretal.2004）软件，预测出84个向日葵miRNA的靶基因。psRNATarget能够根据评分情况来判断miRNA和靶基因的互补程度，另外根据miRNA与靶基因结合的自由能可评价
8小麦旗叶高表达的tae-miR9663和tae-miR5062功能的初步研究白现象，但没有出现在系统叶片中。所以，VIGS的有效性需要病毒的不断复制与转录，以及大量的dsRNA来维持。图1-3植物中病毒诱导的基因沉默的机制Fig.1-3Themechanismofvirus-inducedgenesilencinginplant1.3.2VIGS在植物基因功能中的研究VIGS技术由于具有多种优势而被广泛应用，它的操作简单，实验周期较短，在植物当代就可观察分析表型变化，不需要得到转基因株系，并且能够弥补传统方法可能导致植物突变甚至死亡的不足，快速有效地鉴定基因功能（Burch-Smithetal.2004;王宏芝等2005;杨迎伍等2007）。1995年，Kumagai等研究人员首先将PDS基因片段连接到烟草花叶病毒（Tobaccomosaicvirus,TMV）上侵染本氏烟草，发现其叶片白化，这种现象是由于类胡萝卜素合成途径中的关键酶PDS基因被沉默，植物无法进行光保护作用而导致的。此后，有许多研究人员利用其他的病毒载体，比如PVX、TRV、棉花皱缩病毒（Cottonleafcrumplevirus,CLCrV）和大白菜曲叶病毒（Cabbageleafcurlvirus,CaLCuV）等对拟南芥、水稻、小麦、番茄（Liuetal.2002;Liuetal.2012;孙威等2015）等多种植物进行基因沉默，研究基因功能。Burton等（Burtonetal.2000）构建了植物细胞壁的纤维素合成酶基因（Cellulosesynthasegenes,CesA）与PVX的VIGS重组载体，
【参考文献】：
期刊论文
[1]病毒诱导的基因沉默的发展及在植物生物逆境上的应用[J]. 姚丙晨,孙玥,孙林静,马忠友,苏京平,刘学军. 中国农学通报. 2016(09)
[2]病毒诱导的基因沉默及其在植物研究中的应用[J]. 孙威,许奕,许桂莺,孙佩光,宋顺,常胜合. 生物技术通报. 2015(10)
[3]植物miRNA的研究方法概述[J]. 易小娅,杨瑞瑞,曾幼玲. 植物生理学报. 2015(04)
[4]miRNA的鉴定及检测方法的概述[J]. 丛立新,张金玉,赵志辉. 饲料工业. 2014(03)
[5]4条小麦保守MicroRNAs的表达谱分析及其靶基因预测[J]. 闫妍,韩冉,赵惠贤. 麦类作物学报. 2012(06)
[6]Virus-induced Gene Silencing in Eggplant（Solanum melongena）[J]. Haiping Liu,Daqi Fu,Benzhong Zhu,Huaxue Yan,Xiaoying Shen,Jinhua Zuo,Yi Zhu and Yunbo Luo Laboratory of Fruit Biology,College of Food Science&Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China. Journal of Integrative Plant Biology. 2012(06)
[7]病毒诱导的基因沉默技术及其在植物中的研究进展[J]. 张新华,李富军. 西北植物学报. 2012(02)
[8]病毒诱导的基因沉默及其在植物功能基因组研究中的应用[J]. 黄昌军,钱亚娟,李正和,周雪平. 中国科学:生命科学. 2012(01)
[9]利用BSMV-VIGS技术快速分析小麦TNBL1基因的抗黄矮病功能[J]. 赵丹,赵继荣,黄茜,李宁,刘艳,黄占景,张增艳. 作物学报. 2011(11)
[10]高表达miR396小分子导致拟南芥花柱头弯曲[J]. 刘冬梅,杨凤玺,余迪求. 云南植物研究. 2009(04)
本文编号：3338947
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
采用颈环引物反转录PCR的原理
4小麦旗叶高表达的tae-miR9663和tae-miR5062功能的初步研究加尾法是先在miRNA的3′末端加入poly（A）尾，然后加入含接头序列的poly（T）进行逆转录反应，获得有接头的cDNA第一链，为后续PCR反应提供反向通用引物的序列，再利用miRNA特异性引物作为正向引物便可PCR扩增（ShiandChiang2005）（图1-2）。此法也可用SYBRGreen染料定量检测miRNA。Xue等（2009）使用这种方法分析了水稻籽粒相关的小RNA，鉴定出26个新的miRNA和12个候选miRNA。Yang等（2011）用此方法对高通量测序结果进行验证，比较了地黄中89个保守的miRNA和6个新的miRNA。图1-2采用加尾法进行qRT-PCR的原理Fig.1-2SchematicdescriptionofpolyAqRT-PCR1.1.3植物miRNA靶基因的预测及其实验验证miRNA通过调控其靶基因来发挥生物学功能，因此要研究miRNA的功能，首先要进行靶基因的鉴定。由于miRNA数量多，利用传统的方法筛选靶基因效率很低，因而生物信息学技术成为预测靶基因的首要方法。结合植物miRNA和其靶基因高度匹配的特点，已有很多预测的软件被设计出来，比如BLAST、miRU、psRNATarget以及PatScan等（易小娅等2015）。Barozai等（2012）通过序列比对和RNA-hybrid（Rehmsmeieretal.2004）软件，预测出84个向日葵miRNA的靶基因。psRNATarget能够根据评分情况来判断miRNA和靶基因的互补程度，另外根据miRNA与靶基因结合的自由能可评价
8小麦旗叶高表达的tae-miR9663和tae-miR5062功能的初步研究白现象，但没有出现在系统叶片中。所以，VIGS的有效性需要病毒的不断复制与转录，以及大量的dsRNA来维持。图1-3植物中病毒诱导的基因沉默的机制Fig.1-3Themechanismofvirus-inducedgenesilencinginplant1.3.2VIGS在植物基因功能中的研究VIGS技术由于具有多种优势而被广泛应用，它的操作简单，实验周期较短，在植物当代就可观察分析表型变化，不需要得到转基因株系，并且能够弥补传统方法可能导致植物突变甚至死亡的不足，快速有效地鉴定基因功能（Burch-Smithetal.2004;王宏芝等2005;杨迎伍等2007）。1995年，Kumagai等研究人员首先将PDS基因片段连接到烟草花叶病毒（Tobaccomosaicvirus,TMV）上侵染本氏烟草，发现其叶片白化，这种现象是由于类胡萝卜素合成途径中的关键酶PDS基因被沉默，植物无法进行光保护作用而导致的。此后，有许多研究人员利用其他的病毒载体，比如PVX、TRV、棉花皱缩病毒（Cottonleafcrumplevirus,CLCrV）和大白菜曲叶病毒（Cabbageleafcurlvirus,CaLCuV）等对拟南芥、水稻、小麦、番茄（Liuetal.2002;Liuetal.2012;孙威等2015）等多种植物进行基因沉默，研究基因功能。Burton等（Burtonetal.2000）构建了植物细胞壁的纤维素合成酶基因（Cellulosesynthasegenes,CesA）与PVX的VIGS重组载体，
【参考文献】：
期刊论文
[1]病毒诱导的基因沉默的发展及在植物生物逆境上的应用[J]. 姚丙晨,孙玥,孙林静,马忠友,苏京平,刘学军. 中国农学通报. 2016(09)
[2]病毒诱导的基因沉默及其在植物研究中的应用[J]. 孙威,许奕,许桂莺,孙佩光,宋顺,常胜合. 生物技术通报. 2015(10)
[3]植物miRNA的研究方法概述[J]. 易小娅,杨瑞瑞,曾幼玲. 植物生理学报. 2015(04)
[4]miRNA的鉴定及检测方法的概述[J]. 丛立新,张金玉,赵志辉. 饲料工业. 2014(03)
[5]4条小麦保守MicroRNAs的表达谱分析及其靶基因预测[J]. 闫妍,韩冉,赵惠贤. 麦类作物学报. 2012(06)
[6]Virus-induced Gene Silencing in Eggplant（Solanum melongena）[J]. Haiping Liu,Daqi Fu,Benzhong Zhu,Huaxue Yan,Xiaoying Shen,Jinhua Zuo,Yi Zhu and Yunbo Luo Laboratory of Fruit Biology,College of Food Science&Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China. Journal of Integrative Plant Biology. 2012(06)
[7]病毒诱导的基因沉默技术及其在植物中的研究进展[J]. 张新华,李富军. 西北植物学报. 2012(02)
[8]病毒诱导的基因沉默及其在植物功能基因组研究中的应用[J]. 黄昌军,钱亚娟,李正和,周雪平. 中国科学:生命科学. 2012(01)
[9]利用BSMV-VIGS技术快速分析小麦TNBL1基因的抗黄矮病功能[J]. 赵丹,赵继荣,黄茜,李宁,刘艳,黄占景,张增艳. 作物学报. 2011(11)
[10]高表达miR396小分子导致拟南芥花柱头弯曲[J]. 刘冬梅,杨凤玺,余迪求. 云南植物研究. 2009(04)
本文编号：3338947
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