油橄榄HMGR基因家族的克隆表达及功能验证
发布时间：2021-08-31 15:10
3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（HMGR）,催化3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A（HMG-Co A）生成甲羟戊酸（MVA）,是MVA途径中第一个关键酶。油橄榄是一种重要的经济油料作物,其含有的萜类物质具有重要营养价值,但关于调控萜类物质代谢途径的关键基因研究较少。为研究萜类合成途径关键酶基因HMGR,本研究采用RT-PCR法克隆油橄榄HMGR基因,进行生物信息学分析及构建原核表达载体,对表达蛋白生物活性进行功能验证,并采用荧光定量PCR分析HMGR在油橄榄不同生长阶段的表达量。结果表明:克隆出油橄榄HMGR基因家族的三个基因,分别命名为Oe HMGR1、Oe HMGR2、Oe HMGR3,m RNA ORF的长度分别为1 713 bp、1 773 bp、1 737 bp,编码570、590、578个氨基酸;基因编码蛋白均有2个跨膜区及HMGR催化活性的结构域,不含信号肽;构建了原核表达载体p ET30b（+）-Oe HMGR,转入到大肠杆菌BL21中成功表达,3个重组酶蛋白分子量大小均在66.268.0 k D之间,分离纯化重组蛋白进行功能验证,GC-...
【文章来源】：基因组学与应用生物学. 2018,37(05)北大核心CSCD
【文章页数】：10 页
【部分图文】：
OeHMGRs基因ORF区克隆注:M:MarkⅢ;1:OeHMGR1;2:OeHMGR2;3:OeHMGR3
沟腟OPMA分析显示：在OeHMGR1蛋白的二级结构中，α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲、延伸链在结构中所占的比例分别为42.46%、7.37%、33.86%、16.32%；在OeHMGR2蛋白的二级结构中，α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲、延伸链所占比例分别为41.55%、7.76%、32.41%、18.28%；在OeHMGR3蛋白的二级结构中α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲、延伸链所占比例分别为37.76%、8.28%、34.83%、19.14%。以人类的HMGR基因(1dqa.1.A)为模板，利用SWISS-MODEL构建三级结构模型(图3)，结果显示，OeHMGR1、OeHMGR2、OeHMGR3编码蛋白与人类的HMGR分别具有56.22%、56.81%、56.45%序列相似性的空间结构。1.3.3对OeHMGR编码蛋白跨膜区与信号肽预测分析利用在线软件TMHMMServer，v.2.0预测跨膜区结果表明：OeHMGR1蛋白含有2个跨膜区，一个位于A35~A57，另一个位于A78~A100；OeHMGR2蛋白含有2个跨膜区，位于A38~A60以及位于A81~A103的多肽链；OeHMGR3蛋白含有2个跨膜区，一个位于A26~A48，另一个位于A69~A91。使用SignalP程序预测OeHMGR1、OeHMGR2、OeHMGR3蛋白均不具有信号肽。1.3.4对OeHMGR编码蛋白构建系统进化树分析在GenBank数据库挑选出25个物种的25条HMGR氨基酸序列与OeHMGR1、OeHMGR2、OeHM-GR3构建系统进化树，通过使用MEGA5.0中的neighbor-joining方法(Larkinetal.,2007)，来源于不同物种的HMGR被聚成了古细菌、真菌、植物和动物四大类。古细菌包括：Thermococcusgammatol－eransEJ3(ACS33648)、Methanocaldococcusjannaschii(WP-010870211)、Methanospir
?锖捅曜?品5.6min处目标峰的质谱图(图11A;图11B)，二者极为相似，说明反应组得到了产物甲瓦龙酸内酯，而对照组未检测到此峰，表明OeHMGR纯化蛋白参与催化了该反应，本研究克隆得到的cDNA编码的蛋白具有HMGR酶的功能。1.5OeHMGR基因在油橄榄不同组织以及果实不同阶段的表达分析1.5.1油橄榄不同组织中OeHMGR基因的表达分析荧光定量PCR分析不同组织中OeHMGR的表达量(图12)，结果表明该基因在组织中的表达量果实>叶>花>根，其中果实和叶中的表达量较高，而在图7OeHMGR2表达产物的SDS-PAGE分析Figure7SDS-PAGEanalysisofexpressedproductsofOeHMGR2的目的条带最浓。经Ni-AgaroseHis标签蛋白纯化试剂盒纯化的蛋白产物仅在该位置处单一明显的条带(图9)，由此证实该条带即为目的产物，表明重组OeHMGR基因家族在大肠杆菌中得到了成功表达。1.4.3蛋白酶功能验证对照组、催化产物、标准品经乙酸乙酯萃取后上图4HMGRS蛋白的系统进化树Figure4PhylogenetictreeofHMGRsprotein图6OeHMGR1表达产物的SDS-PAGE分析Figure6SDS-PAGEanalysisofexpressedproductsofOeHMGR1图5重组质粒pET30b(+)-OeHMGR的酶切鉴定注:1:NotⅠ与KpnⅠ双酶切重组质粒pET30b(+)-OeHMGR结果;2:NotⅠ酶切重组质粒pET30b(+)-OeHMGR结果;3:KpnⅠ酶切重组质粒pET30b(+)-OeHMGR结果;M:DNAMarkerⅢFigure5IdentificationofpET30b(+)-OeHMGRwithrestrictiondigestionNote:1:TheelectrophoreticresultofrecombinantplasmidpET30b(+)-OeHMGRdigestedbyNotⅠandKpnⅠtogether;2:Theelectrophoreticresultofrecombin
【参考文献】：
期刊论文
[1]油橄榄叶中橄榄苦苷的体外抗氧化和抑菌活性[J]. 吴遵秋,姜友军,苏光灿,王安逸,陈华萍,杨泽身,黄乾明. 食品科学. 2014(21)
本文编号：3375114
【文章来源】：基因组学与应用生物学. 2018,37(05)北大核心CSCD
【文章页数】：10 页
【部分图文】：
OeHMGRs基因ORF区克隆注:M:MarkⅢ;1:OeHMGR1;2:OeHMGR2;3:OeHMGR3
沟腟OPMA分析显示：在OeHMGR1蛋白的二级结构中，α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲、延伸链在结构中所占的比例分别为42.46%、7.37%、33.86%、16.32%；在OeHMGR2蛋白的二级结构中，α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲、延伸链所占比例分别为41.55%、7.76%、32.41%、18.28%；在OeHMGR3蛋白的二级结构中α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲、延伸链所占比例分别为37.76%、8.28%、34.83%、19.14%。以人类的HMGR基因(1dqa.1.A)为模板，利用SWISS-MODEL构建三级结构模型(图3)，结果显示，OeHMGR1、OeHMGR2、OeHMGR3编码蛋白与人类的HMGR分别具有56.22%、56.81%、56.45%序列相似性的空间结构。1.3.3对OeHMGR编码蛋白跨膜区与信号肽预测分析利用在线软件TMHMMServer，v.2.0预测跨膜区结果表明：OeHMGR1蛋白含有2个跨膜区，一个位于A35~A57，另一个位于A78~A100；OeHMGR2蛋白含有2个跨膜区，位于A38~A60以及位于A81~A103的多肽链；OeHMGR3蛋白含有2个跨膜区，一个位于A26~A48，另一个位于A69~A91。使用SignalP程序预测OeHMGR1、OeHMGR2、OeHMGR3蛋白均不具有信号肽。1.3.4对OeHMGR编码蛋白构建系统进化树分析在GenBank数据库挑选出25个物种的25条HMGR氨基酸序列与OeHMGR1、OeHMGR2、OeHM-GR3构建系统进化树，通过使用MEGA5.0中的neighbor-joining方法(Larkinetal.,2007)，来源于不同物种的HMGR被聚成了古细菌、真菌、植物和动物四大类。古细菌包括：Thermococcusgammatol－eransEJ3(ACS33648)、Methanocaldococcusjannaschii(WP-010870211)、Methanospir
?锖捅曜?品5.6min处目标峰的质谱图(图11A;图11B)，二者极为相似，说明反应组得到了产物甲瓦龙酸内酯，而对照组未检测到此峰，表明OeHMGR纯化蛋白参与催化了该反应，本研究克隆得到的cDNA编码的蛋白具有HMGR酶的功能。1.5OeHMGR基因在油橄榄不同组织以及果实不同阶段的表达分析1.5.1油橄榄不同组织中OeHMGR基因的表达分析荧光定量PCR分析不同组织中OeHMGR的表达量(图12)，结果表明该基因在组织中的表达量果实>叶>花>根，其中果实和叶中的表达量较高，而在图7OeHMGR2表达产物的SDS-PAGE分析Figure7SDS-PAGEanalysisofexpressedproductsofOeHMGR2的目的条带最浓。经Ni-AgaroseHis标签蛋白纯化试剂盒纯化的蛋白产物仅在该位置处单一明显的条带(图9)，由此证实该条带即为目的产物，表明重组OeHMGR基因家族在大肠杆菌中得到了成功表达。1.4.3蛋白酶功能验证对照组、催化产物、标准品经乙酸乙酯萃取后上图4HMGRS蛋白的系统进化树Figure4PhylogenetictreeofHMGRsprotein图6OeHMGR1表达产物的SDS-PAGE分析Figure6SDS-PAGEanalysisofexpressedproductsofOeHMGR1图5重组质粒pET30b(+)-OeHMGR的酶切鉴定注:1:NotⅠ与KpnⅠ双酶切重组质粒pET30b(+)-OeHMGR结果;2:NotⅠ酶切重组质粒pET30b(+)-OeHMGR结果;3:KpnⅠ酶切重组质粒pET30b(+)-OeHMGR结果;M:DNAMarkerⅢFigure5IdentificationofpET30b(+)-OeHMGRwithrestrictiondigestionNote:1:TheelectrophoreticresultofrecombinantplasmidpET30b(+)-OeHMGRdigestedbyNotⅠandKpnⅠtogether;2:Theelectrophoreticresultofrecombin
【参考文献】：
期刊论文
[1]油橄榄叶中橄榄苦苷的体外抗氧化和抑菌活性[J]. 吴遵秋,姜友军,苏光灿,王安逸,陈华萍,杨泽身,黄乾明. 食品科学. 2014(21)
本文编号：3375114
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