蛹虫草遗传转化体系的建立及营养缺陷型菌株的创制
发布时间：2021-09-25 01:50
CRISPR是一种新型的基因编辑技术,被比喻为精确的分子手术刀,对人类致病基因的挖掘,疾病的靶向治疗,农业作物的品种改良,定向育种都具有巨大的潜力与前景。此项技术操作简单易行,而且实验周期短,成本节约,易于在实验室中开展。CRISPR技术先后应用于植物,动物及人体细胞中。蛹虫草作为一种食药用真菌,很多功效都接近于冬虫夏草,具有减缓疲劳,软化心血管,抗肿瘤,防辐射等作用,产业化生产蛹虫草子实体体系已建立。目前尚未有蛹虫草遗传转化体系建立的报道,本实验首次在蛹虫草中建立遗传转化体系,并首次利用CRISPR技术对蛹虫草中尿嘧啶合成的关键酶基因URA3进行基因编辑,使其成为一种新型的筛选标记,为进一步研究蛹虫草的代谢调控,菌种优化奠定了基因工程基础。实验中使用正交的方法,对农杆菌介导蛹虫草转化的条件进行优化,得到最优的农杆菌转化条件,建立农杆菌介导蛹虫草原生质体遗传转化体系。成功克隆了真菌GPD启动子,并将其成功构建到敲除载体pFGC-pcoCas9上,从而实现了对植物敲除载体的改造,最终得到适用于蛹虫草的敲除载体。运用农杆菌遗传转化法,将其敲除载体转入到蛹虫草原生质体中,最后得到了突变的转化...
【文章来源】：吉林农业大学吉林省
【文章页数】：50 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
II型CRISPR/Cas9基因座组成图
图 2.1 表达载体 pFGC-pcoCas9 图谱Fig 2.1 The Map of expression vector pFGC-pcoCas9载体双酶切 I 和 Nco I 两种内切酶，将连结 GPD 基因序列的克隆载体质粒进行-pcoCas9 的载体使用相同的限制性内切酶 Pme I 和 Nco I 酶切，将 PCR 管一起置于恒温水浴锅中，过夜 37 ℃酶切。双酶切体系如表表 2-4 质粒酶切反应体系Tab. 2-4 Restriction system of plasmid组分 体积 μLDNA 10Pme I- Buffer 5Pme I 2.5Nco I 2.5
3 野生型蛹虫草分别在含与不含卡潮霉素+卡那霉素浓度的 PDA 培养基上生长 Wild Cordyceps Militaris on PDA plate with/without hygromycin + Kan in 7-15 day立农杆菌转化法 农杆菌转化蛹虫草条件的确定为带有荧光蛋白的质粒通过农杆菌转化，可以使用荧光倒置显微镜在实验效果，从而证明正交试验的结果是否准确。结果显示在诱导剂乙0 μM/L，共培养的时间为 2 天，农杆菌与蛹虫草原生质体的体积比例为佳。下表为正交试验的结果，可以看出 KA＞KB＞KC，说明 A 代表的浓度高低对农杆菌转化的影响较大。其次是共培养的培养时间，农积例对其效果的影响相对较弱。表 3-6 农杆菌转化正交试验Table 3-6 Agrobacterium transformation orthogonal test试验号 试验因素水平
本文编号：3408852
【文章来源】：吉林农业大学吉林省
【文章页数】：50 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
II型CRISPR/Cas9基因座组成图
图 2.1 表达载体 pFGC-pcoCas9 图谱Fig 2.1 The Map of expression vector pFGC-pcoCas9载体双酶切 I 和 Nco I 两种内切酶，将连结 GPD 基因序列的克隆载体质粒进行-pcoCas9 的载体使用相同的限制性内切酶 Pme I 和 Nco I 酶切，将 PCR 管一起置于恒温水浴锅中，过夜 37 ℃酶切。双酶切体系如表表 2-4 质粒酶切反应体系Tab. 2-4 Restriction system of plasmid组分 体积 μLDNA 10Pme I- Buffer 5Pme I 2.5Nco I 2.5
3 野生型蛹虫草分别在含与不含卡潮霉素+卡那霉素浓度的 PDA 培养基上生长 Wild Cordyceps Militaris on PDA plate with/without hygromycin + Kan in 7-15 day立农杆菌转化法 农杆菌转化蛹虫草条件的确定为带有荧光蛋白的质粒通过农杆菌转化，可以使用荧光倒置显微镜在实验效果，从而证明正交试验的结果是否准确。结果显示在诱导剂乙0 μM/L，共培养的时间为 2 天，农杆菌与蛹虫草原生质体的体积比例为佳。下表为正交试验的结果，可以看出 KA＞KB＞KC，说明 A 代表的浓度高低对农杆菌转化的影响较大。其次是共培养的培养时间，农积例对其效果的影响相对较弱。表 3-6 农杆菌转化正交试验Table 3-6 Agrobacterium transformation orthogonal test试验号 试验因素水平
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