基于多反应监测质谱技术的水稻叶片蛋白绝对定量方法

发布时间：2021-10-29 10:44

　　【目的】建立水稻叶片蛋白的多反应监测（MRM）质谱绝对定量方法。【方法】水稻叶片蛋白经含1.0%十二烷基硫酸钠（SDS）的磷酸盐（PBS）缓冲液提取,丙酮沉淀除杂纯化、胰蛋白酶消化,酶解液经液相色谱分离,MRM质谱监测,外标法定量。【结果】向提取缓冲液中加入1.0%SDS可增强水稻叶片中16种靶蛋白和总蛋白质的提取效果;不同有机试剂处理,总蛋白质沉淀量存在显著差异（P<0.05）,沉淀能力从强到弱依次为乙腈>丙酮>异丙醇>甲醇>乙醇;对于16种目标蛋白,总体以丙酮沉淀效果最好,其次是异丙醇和乙腈,甲醇和乙醇效果较差。该方法线性范围均达到3个数量级,定量限为0.1～2.5 nmol/L,灌浆期16种水稻叶片蛋白质含量为6.0～2818.1μg/g,相对标准偏差均小于14%。【结论】SDS可显著提高水稻叶片蛋白提取效果,采用丙酮或乙腈可获得较好的蛋白沉淀效果,但不同蛋白质略有差异。结合MRM质谱监测技术可实现水稻叶片蛋白的绝对定量,方法线性范围宽、敏度高、重复性好。 

【文章来源】：中国水稻科学. 2020,34(03)北大核心CSCD

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【部分图文】：

16种特征肽段的总离子流

Bereman等[13]研究表明，过高浓度的SDS会抑制胰蛋白酶活性，干扰RPLC的分离和MS分析。因此，SDS残留量可作为粗蛋白沉淀除杂的一项重要指标。实验结果显示，采用上述5种有机试剂对SDS的去除率均可达94.2%以上，均能保证样品中SDS浓度低于0.01%，符合HPLC和LC/MS分析条件[21]。综上，实验选择丙酮作为16种目标蛋白的沉淀剂。图3 五种有机试剂对16种水稻叶片蛋白沉淀效果比较

五种有机试剂对16种水稻叶片蛋白沉淀效果比较


本文编号：3464514