烟草西柏三烯二醇合成酶基因（NtCYP71D16）的表达特性和调控研究
发布时间：2021-11-17 18:33
细胞色素P450羟化酶基因（Cytochrome P450 hydroxylase,NtCYP71D16）催化烟草西柏三烯一醇脱氢生成西柏三烯二醇,是烟草西柏烷类腺毛分泌物生物合成的关键酶基因,对烟草叶面化学的形成具有重要影响。本文克隆了烟草栽培品种K326的NtCYP71D16基因,采用RT-PCR技术和Promotor-GUS infusion技术,分析了该基因的组织表达特性以及对温度和MeJA的应答反应模式;比较了典型烤烟品种中叶面腺毛的形态、西柏烷类化合物积累以及西柏烷代谢途径关键酶基因（NtCYP71D16和NtCYC）表达的差异;在此基础上,采用RNAi技术,实现了NtCYP71D16基因在K326中的抑制表达,并对RNAi转基因植株的农艺性状、叶面化学成分、抗性及烤后烟叶香气成分进行了比较分析。该研究结果为NtCYP71D16基因在烟草叶面化学调控及抗性及品质改良中的应用奠定了理论基础。主要研究结果如下:1、采用同源克隆技术,在烤烟K326中获得三条NtCYP71D16（AF166332.1）基因同源序列NtCYP71D16,NtCYP71D16v2,NtCYP71D16...
【文章来源】：河南农业大学河南省
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【图文】：
PCR扩增检测结果
26ORFfinder分析发现,它们均包含起始和终止密码子，它们均编码499个氨基酸;序列比对结果见图3。NtCYP71D16蛋白与NtCYP71D16v2以及NtCYP71D16v3的序列一致性均为93.9%，而NtCYP71D16v2与NtCYP71D16v3的一致性达96.1%。氨基酸序列比对见下图。图3氨基酸序列比对使用PROSITE(http://www.expasy.ch/prosite/)和SMART软件对该基因的蛋白质结构域进行了分析和预测。如图4所示，3个蛋白均包含P450蛋白家族保守的结构域，进一步表明克隆到的基因为烟草腺毛P450家族基因。图4.蛋白质结构域分析4.1.2NtCYP71D16基因组织表达特异性分析为了探究不同组织该基因的相对表达量的差异，对K326的上部叶、中部叶、下部叶、根、茎、花、种子、去腺毛的叶片和腺毛做了RT-PCR检测，结果如下表（4）：每个组织做三次重复，以去腺毛叶片为对照，并作图。表4烟草组织RT-PCR结果内参基因Ct烟草部位CtΔCtΔΔCt相对表达量均值根-L2519.86根29.659.791.753333330.29661565929.699.840.28791433719.851.803333330.2865118419.8429.719.871.833333330.280615512茎-L2521.56茎32.9411.383.343333330.09852725432.7211.210.09520494821.513.173333330.11084892421.5533.311.753.713333330.076238665上部叶-L2521.29上部叶30.489.191.153333330.4495852680.474690745
2721.3330.359.020.983333330.5058097221.3230.459.131.093333330.468677248中部叶-L2521.44中部叶30.579.131.093333330.46867724830.569.10.47088075321.461.063333330.47852515421.4330.579.141.103333330.465439858下部叶-L2522.29下部叶30.428.130.093333330.93735449730.448.140.9816572622.30.103333330.93087971622.3130.247.93-0.10666671.076737568花-L2523.14花27.033.89-4.146666717.7121405127.053.9417.1156506423.11-4.096666717.1087999823.1227.113.99-4.046666716.52601144种子-L2520.06种子33.5313.475.433333330.02314214933.4713.40.02455073920.075.363333330.024292720.0333.3213.295.253333330.026217368去腺毛叶片-L2522.98去腺毛叶片30.687.7-0.33666671.26283545131.228.231.01428096122.990.193333330.8745826722.9831.168.180.143333330.905424761腺毛-L2522.33腺毛27.745.41-2.62666676.17597394727.815.495.95387623522.32-2.54666675.84282737822.3327.825.49-2.54666675.842827378如图5可知，烟草K326品种中，花中NtCYP71D16基因的表达量最高，其次是腺毛中，花与腺毛中该基因的表达量呈极显著性差异，而种子中含量最少。不同部位的叶片该基因的相对表达量也有区别，下部叶含量最高，与去腺毛叶片中该基因的表达量无极显著性差异。图5NtCYP71D16基因在不同组织中的表达量4.1.3NtCYP71D6基因启动子活性分析4.1.3.1组织特性分析以pCAMBIA1391-CYP-GUS转基因植株为材料，分别取其根、茎、叶等部位为材料，进行GUS组织化学染色，在超景深显微镜下进行观察，从图6可发现，转基因植株的茎、
【参考文献】：
期刊论文
[1]烟草重要基因篇13: 烟草腺毛发生和发育相关基因[J]. 张洪映,崔红. 中国烟草科学. 2016(01)
[2]植物腺毛次生代谢产物生物合成的研究进展[J]. 李好勋,王国栋. 中国科学:生命科学. 2015(06)
[3]烟草重要基因篇:8.烟草P450基因[J]. 解敏敏. 中国烟草科学. 2015(02)
[4]4个烤烟品种不同采收期烟叶腺毛密度和形态比较[J]. 张亚婕,徐琼华,毛自朝,浦卫琼,李军营,陈严平. 云南农业大学学报(自然科学). 2015(01)
[5]不同品种(系)烤烟西柏三烯二醇代谢差异研究[J]. 王冬,孙九哲,彭玉富,张小全,李丽华,宋洋洋,杨铁钊. 中国烟草学报. 2014(06)
[6]10个烤烟品种间的腺毛密度比较研究[J]. 薛晓明,侯森林,于丽杰. 安徽农业大学学报. 2014(06)
[7]烟草腺毛及其分泌物西柏三烯醇类物质的研究进展[J]. 韩锦峰,张志勇,刘华山,王晓军,刘晗,毛官杰. 中国烟草学报. 2013(05)
[8]烤烟腺毛的形态学观察[J]. 张亚婕,徐琼华,毛自朝,浦卫琼,李军营,陈严平. 电子显微学报. 2013(05)
[9]外源MeJA诱导烟草叶面防御反应[J]. 冯琦,王永,武东玲,魏跃伟,崔红. 中国烟草科学. 2013(05)
[10]植物角质层蜡质的化学组成研究综述[J]. 曾琼,刘德春,刘勇. 生态学报. 2013(17)
博士论文
[1]烟草西柏三烯二醇积累的遗传及生态响应研究[D]. 王冬.河南农业大学 2014
硕士论文
[1]AtPAP1基因在烟草中的过表达及花青素合成调控[D]. 武东玲.河南农业大学 2014
[2]腺毛分泌物对烤烟香味物质影响及水分调控作用的研究[D]. 李鹏飞.湖南农业大学 2006
本文编号：3501454
【文章来源】：河南农业大学河南省
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【图文】：
PCR扩增检测结果
26ORFfinder分析发现,它们均包含起始和终止密码子，它们均编码499个氨基酸;序列比对结果见图3。NtCYP71D16蛋白与NtCYP71D16v2以及NtCYP71D16v3的序列一致性均为93.9%，而NtCYP71D16v2与NtCYP71D16v3的一致性达96.1%。氨基酸序列比对见下图。图3氨基酸序列比对使用PROSITE(http://www.expasy.ch/prosite/)和SMART软件对该基因的蛋白质结构域进行了分析和预测。如图4所示，3个蛋白均包含P450蛋白家族保守的结构域，进一步表明克隆到的基因为烟草腺毛P450家族基因。图4.蛋白质结构域分析4.1.2NtCYP71D16基因组织表达特异性分析为了探究不同组织该基因的相对表达量的差异，对K326的上部叶、中部叶、下部叶、根、茎、花、种子、去腺毛的叶片和腺毛做了RT-PCR检测，结果如下表（4）：每个组织做三次重复，以去腺毛叶片为对照，并作图。表4烟草组织RT-PCR结果内参基因Ct烟草部位CtΔCtΔΔCt相对表达量均值根-L2519.86根29.659.791.753333330.29661565929.699.840.28791433719.851.803333330.2865118419.8429.719.871.833333330.280615512茎-L2521.56茎32.9411.383.343333330.09852725432.7211.210.09520494821.513.173333330.11084892421.5533.311.753.713333330.076238665上部叶-L2521.29上部叶30.489.191.153333330.4495852680.474690745
2721.3330.359.020.983333330.5058097221.3230.459.131.093333330.468677248中部叶-L2521.44中部叶30.579.131.093333330.46867724830.569.10.47088075321.461.063333330.47852515421.4330.579.141.103333330.465439858下部叶-L2522.29下部叶30.428.130.093333330.93735449730.448.140.9816572622.30.103333330.93087971622.3130.247.93-0.10666671.076737568花-L2523.14花27.033.89-4.146666717.7121405127.053.9417.1156506423.11-4.096666717.1087999823.1227.113.99-4.046666716.52601144种子-L2520.06种子33.5313.475.433333330.02314214933.4713.40.02455073920.075.363333330.024292720.0333.3213.295.253333330.026217368去腺毛叶片-L2522.98去腺毛叶片30.687.7-0.33666671.26283545131.228.231.01428096122.990.193333330.8745826722.9831.168.180.143333330.905424761腺毛-L2522.33腺毛27.745.41-2.62666676.17597394727.815.495.95387623522.32-2.54666675.84282737822.3327.825.49-2.54666675.842827378如图5可知，烟草K326品种中，花中NtCYP71D16基因的表达量最高，其次是腺毛中，花与腺毛中该基因的表达量呈极显著性差异，而种子中含量最少。不同部位的叶片该基因的相对表达量也有区别，下部叶含量最高，与去腺毛叶片中该基因的表达量无极显著性差异。图5NtCYP71D16基因在不同组织中的表达量4.1.3NtCYP71D6基因启动子活性分析4.1.3.1组织特性分析以pCAMBIA1391-CYP-GUS转基因植株为材料，分别取其根、茎、叶等部位为材料，进行GUS组织化学染色，在超景深显微镜下进行观察，从图6可发现，转基因植株的茎、
【参考文献】：
期刊论文
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[8]烤烟腺毛的形态学观察[J]. 张亚婕,徐琼华,毛自朝,浦卫琼,李军营,陈严平. 电子显微学报. 2013(05)
[9]外源MeJA诱导烟草叶面防御反应[J]. 冯琦,王永,武东玲,魏跃伟,崔红. 中国烟草科学. 2013(05)
[10]植物角质层蜡质的化学组成研究综述[J]. 曾琼,刘德春,刘勇. 生态学报. 2013(17)
博士论文
[1]烟草西柏三烯二醇积累的遗传及生态响应研究[D]. 王冬.河南农业大学 2014
硕士论文
[1]AtPAP1基因在烟草中的过表达及花青素合成调控[D]. 武东玲.河南农业大学 2014
[2]腺毛分泌物对烤烟香味物质影响及水分调控作用的研究[D]. 李鹏飞.湖南农业大学 2006
本文编号：3501454
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