玉米中STOMAGEN-Like基因调控气孔发育的功能研究

发布时间：2021-12-18 12:36

　　气孔是植物与外界环境进行气体交换的主要通道,气孔密度影响植物的光合作用效率和蒸腾速率。因此,对气孔发育的研究一直是植物发育生物学和作物育种研究领域的热点和前沿。鉴于禾本科植物叶片中气孔构成和分布的特殊性,对气孔发育的研究相对于模式植物拟南芥中气孔的研究较滞后。近年来,在禾本科植物中也鉴定出了一些促进气孔发育的关键转录因子,明确了它们在气孔发育中的功能,但调控转录因子活性的信号分子和机制尚未见报道。STOMAGEN基因是促进拟南芥气孔发育的关键信号分子,玉米基因组中存在两个STOMAGN-Like基因——ZmSTOMAGEN1和ZnSTOMAGEN2基因,本实验室前期从玉米中克隆了STOMAGE 的同源基因ZmSTOMAGEN1,分析了该基因蛋白质序列和三维结构,并对其在玉米中的组织表达特性进行了研究,初步表明该基因可能与玉米气孔发育有关,但缺乏充分的实验证据。本研究利用CRISPR/Cas9基因组编辑、植物遗传转化、显微成像和基因表达定量检测等技术手段,进一步分析了玉米中STOMAGEN-Like基因在气孔发育过程中的功能,获得了一些有意义的结果,如下:1、构建了ZmSTOMAGEN1... 

【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校

【文章页数】：87 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
第一章 综述
    1.1 植物气孔发育的分子调控机制研究进展
        1.1.1 气孔的发育模式
        1.1.2 转录因子对气孔发育的调控
        1.1.3 气孔发育过程中的细胞信号转导
        1.1.4 调控气孔发育起始的分子机制
        1.1.5 保卫细胞终末分化状态的维持
    1.2 CRISPR/Cas9介导的基因组靶向编辑技术研究进展
        1.2.1 基因组编辑技术
        1.2.2 CRISPR/Cas9在植物基因功能研究中的应用
    1.3 研究目的及意义
    1.4 研究的主要内容
第二章 材料与方法
    2.1 试验材料
        2.1.1 植物材料及其处理方法
        2.1.2 试剂、菌种和仪器
    2.2 引物设计
    2.3 基础分子实验操作
        2.3.1 玉米及拟南芥基因组DNA的提取
        2.3.2 玉米及拟南芥总RNA的提取
        2.3.3 cDNA的获得
        2.3.4 目的片段的PCR扩增
        2.3.5 酶切反应
        2.3.6 连接反应
        2.3.7 重组质粒的大肠杆菌转化
        2.3.8 电转感受态农杆菌制备
        2.3.9 农杆菌电转化
    2.4 CRISPR/Cas9载体构建
        2.4.1 靶位点选择
        2.4.2 靶点接头设计
        2.4.3 sgRNA表达盒的构建
        2.4.4 sgRNA表达盒插入pYLCRISPR/Cas9Pubi-B载体
        2.4.5 连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞
    2.5 蛋白亚细胞定位
        2.5.1 溶液
        2.5.2 侵染液制备
        2.5.3 烟草培养及侵染叶片
        2.5.4 激光共聚焦成像
    2.6 拟南芥转基因
        2.6.1 培养基及溶液
        2.6.2 野生型拟南芥种植
        2.6.3 侵染液的制备
        2.6.4 花序(Floral-dip)法转化拟南芥:
        2.6.5 转基因拟南芥植株的筛选
        2.6.6 转基因拟南芥植株的分子鉴定
    2.7 玉米转基因
        2.7.1 储备液及培养基
        2.7.2 农杆菌介导的玉米幼胚遗传转化
        2.7.3 转基因玉米的分子鉴定
    2.8 光合参数测定及光响应曲线的拟合
    2.9 实时荧光定量PCR
    2.10 TBO染色
        2.10.1. 试剂及储备液
        2.10.2. 染色步骤
    2.11 气孔扫描电镜观察
    2.12 真核表达
        2.12.1 酵母培养与表达所需培养基
        2.12.2 酵母GS115感受态制备
        2.12.3 重组质粒点转化毕赤酵母
        2.12.4 多拷贝重组毕赤酵母的筛选
        2.12.5 重组毕赤酵母诱导表达外源蛋白
第三章 结果与分析
    3.1 ZmSTOMAGEN1基因在拟南芥中的功能
        3.1.1 ZmSTOMAGEN1超表达载体的构建
        3.1.2 超表达ZmSTOMAGEN1拟南芥植株的获得
        3.1.3 超表达ZmSTOMAGEN1提高拟南芥的气孔指数/密度
    3.2 ZmSTOMAGEN1亚细胞定位
    3.3 CRISPR/Cas9靶向修饰玉米ZmSTOMAGEN-like基因
        3.3.1 ZmSTOMAGEN-like基因靶位点的选择及CRISPR/Cas9载体的构建
        3.3.2 CRISPR/Cas9系统转化玉米
        3.3.3 转基因植株的分子鉴定
        3.3.4 ZmSTOMAGEN-like基因编辑结果
    3.4 STOMAGEN-like基因缺失对玉米气孔发育的影响
        3.4.1 ZmSTOMAGEN-like基因缺失导致气孔指数/密度的减少
        3.4.2 ZmSTOMAGEN-like基因缺失对气孔发育相关基因表达的影响
        3.4.3 ZmSTOMAGEN-like基因的缺失对玉米气孔分布和形态结构的影响
    3.5 ZmSTOMAGEN-like基因的缺失对玉米光合参数的影响
    3.6 外源表达玉米STOMAGEN蛋白
        3.6.1 外源表达载体的构建
        3.6.2 外源蛋白的诱导表达及纯化
第四章 讨论
    4.1 玉米中气孔发育相关基因的预测
    4.2 ZmSTOMAGEN1基因正调控拟南芥气孔的发育
    4.3 CRISPR/Cas9系统靶向修饰玉米ZmSTOMAGEN-like基因
    4.4 ZmSTOMAGEN-like基因是玉米气孔发育的正调控因子
    4.5 玉米气孔密度对光合作用的影响
第五章 结论与展望
    5.1 结论
    5.2 展望
参考文献
附录
致谢
攻读硕士学位期间发表的论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]Efficient Targeted Genome Modification in Maize Using CRISPR/Cas9 System[J]. Chao Feng,Jing Yuan,Rui Wang,Yang Liu,James A.Birchler,Fangpu Han.  Journal of Genetics and Genomics. 2016(01)
[2]植物CRISPR/Cas9基因组编辑系统与突变分析[J]. 马兴亮,刘耀光.  遗传. 2016(02)
[3]Targeted Mutagenesis in Zea mays Using TALENs and the CRISPR/Cas System[J]. Zhen Liang,Kang Zhang,Kunling Chen,Caixia Gao.  Journal of Genetics and Genomics. 2014(02)
[4]气孔蛋白同源物在单、双子叶植物中的生物信息学分析[J]. 樊宪伟,韦葳,廖权能,李有志.  基因组学与应用生物学. 2013(06)
[5]CRISPR/Cas系统:RNA靶向的基因组定向编辑新技术[J]. 李君,张毅,陈坤玲,单奇伟,王延鹏,梁振,高彩霞.  遗传. 2013(11)
[6]气孔发育及其调控[J]. 崔国新,韩宝达,赵潇男,李立新.  植物生理学报. 2012(09)

硕士论文
[1]玉米ZmSTOMAGEN基因的克隆及表达特性分析[D]. 韦葳.广西大学 2013



本文编号：3542407