TALENs与CRISPR/Cas9介导的大豆基因定点编辑及黄绿叶基因cd1的图位克隆和功能分析
发布时间：2022-01-11 22:50
一、TALENs与CRISPR/Cas9介导的大豆基因定点编辑大豆[Glycine Max（L.）Merr.]起源于中国,是重要的油料和高蛋白作物,含有多种对人类有益的生理活性物质,如异黄酮等,此外大豆也是农业生产体系中重要的养地作物（能固氮,对化肥需求较少）。基因组定点编辑技术（或称基因打靶技术）是对基因组特定位点进行操作,诱发该位点DNA序列的改变,如碱基的插入缺失、基因的插入或替换以及大片段DNA的缺失等。目前应用比较广泛的是转录激活样效应因子核酸酶（Transcription Activator-like Effectors Nucleases,TALENs）和 Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）/CRISPR-associated（Cas）9技术。基因组定点编辑技术依赖于转基因技术,但基因编辑后的生物可以不含任何新引入的遗传物质或外源DNA,是一种“非转基因的遗传修饰”。相比于传统育种技术的周期长、效率低的缺点,以及转基因育种技术中引入外源DNA的生物安全问题,基因组定点编辑技术在...
【文章来源】：南京农业大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：161 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１－１人工设计的核酸酶编辑基因组的修复结果（Ｋｉｍ?ａｎｄ?Ｋｉｍ?２０１４）??Ｆｉｇ．?１－１?Ｏｕｔｃｏｍｅ?ｏｆ?ｇｅｎｏｍｅ?ｅｄｉｔｉｎｇ?ｕｓｉｎｇ?ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ?ｎｕｃｌｅａｓｅｓ??
ｒｅｐｅａｔｓ?（ＣＲＩＳＰＲ）?／ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ?（Ｃａｓ）?９。ＺＦＮｓ、ＴＡＬＥＮｓ?和?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ是研究比较多的，现在普遍采用的是后两种技术，特别是ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术。??Ｕ归巢核酸内切酶??归巢核酸内切酶（ＨｏｍｉｎｇＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）是最早用于基因打粑的工具酶，能够别长度为１４？４０ｂｐ的核甘酸序列，故又名大范围核酸酶（ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅｓ）?（Ｓｔｏｄｄａ２０１１；?Ｂｅｌｆｏｒｔ?ａｎｄ?Ｂｏｎｏｃｏｒａ?２０１４）。归巢核酸内切酶是由嵌入在内含子（ｇｒｏｕｐ?Ｉ、ｇｒｏｕＩＩ和ａｒｃｈａｅｌ类内含子）里的ＯＲＦ编码，或者是由内含肽切割产生的内切酶，能够使内含子在ＤＮＡ水平上的移动。归巢核酸内切酶识别的序列被称为归巢位点，由含子间或内含子侧翼的ＤＮＡ片段组成，内切酶识别并切割同源等位基因中非内含区域的归巢位点，然后利用修复机制插入内含子（Ｓｔｏｄｄａｒｄ２００５）。目前ＬＡＧＬＩＤＡＤ归巢核酸酶家族在基因打靶中使用最多，其包含一个或两个ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ片段的贝。含有两个ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ片段拷贝的酶被１００个左右氨基酸残基分隔开，以单的形式发挥作用，如Ｉ－Ｄｍｏｌ和Ｉ－Ｓｃｅｌ等；只有一个ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ片段拷贝的酶可形成同型二聚体后识别具有回文结构的归巢位点，包括Ｉ－Ｃｒｅｌ和Ｉ－ＣｅｕＩ等（图１－２）Ｉｎｒｎａｌｌｓｍｍｅｒｉｃｍｏｎｏｍｅｒ??
２个互补的ＺＦＮｓ在靶位点分别通过锌指结构以尾对尾的方式识别５’一３＇和３＇—５’的??ＤＮＡ链，然后２个ＦｏｋＩ核酸酶形成二聚体，激活内切酶活性来切割靶位点，产生双??链缺口（ＤＳＢｓ），从而诱发ＤＮＡ损伤修复机制（图１－３）。２个ＺＦＮ就可以在基因??组中特异性地结合１８？２４ｂｐ长度的序列。目前识别每一种三联碱基的６４种锌指组合??中己有大部分被发现并编撰成目录。针对每一条需要识别的目标序列（打靶位点），??我们都可以使用与密码子对应的类似方式对锌指结构进行模块化组装（ｍｏｄｕｌａｒ??ａｓｓｅｍｂｌｙ），从而获得能够识另Ｕ特定ＤＮＡ序歹Ｕ的锌指蛋白结构。??（Ｑ?１?Ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ?ｍｏｔｉｆ?ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ?Ｉ?ｈ??Ｋ?｝?ＣＸ“ＣＸ，ＦＩＸ，ＨＸ，Ｈ?Ｕ??；；Ｒｉｇｈｔ?ＺＦＰ?（??ｌｅｆｔ?ＺＦＰ??图１－３锌指核酸酶设计的结构示意图（Ｋｉｍ?ａｎｄ?Ｋｉｍ?２０１４）??Ｆｉｇ．?１－３?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｄｅｓｉｇｎｅｄ?ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ??（ａ）锌指的原理示意图；（ｂ）锌指结合ＤＮＡ的计算机模型。??（ａ）?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ?ｏｆ?ａ?ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ?ｎｕｃｌｅａｓｅ?（ＺＦＮ）?ｐａｉｒ；?（ｂ）?Ｃｏｍｐｕｔｅｒ?ｍｏｄｅｌ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ａ?ＺＦＮ?ｐａｉｒ??ｂｏｕｎｄ?ｔｏ?ＤＮＡ．??第一个锌指核酸酶是由约翰霍普金斯大学Ｃｈａｎｄｒａ实验室设计（Ｋｉｍ?ｅｔ?ａｌ．?１９９６），??该酶使用３个锌指结构域连接一个Ｆｏｋ?Ｉ核酸酶的催化活性功能域
【参考文献】：
期刊论文
[1]大豆转基因研究进展[J]. 姚丙晨,闫双勇,苏京平,马忠友,王晓静,孙玥,刘学军. 大豆科技. 2015(05)
[2]商业化转基因大豆育种研发进展与展望[J]. 高初蕾,乔峰,安怡昕,赵团结,孔杰杰. 分子植物育种. 2015(06)
[3]小菜蛾U6 snRNA基因的克隆及作为miRNA定量表达分析内参基因的评价[J]. 封冰,梁沛,高希武. 昆虫学报. 2014(03)
[4]CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术[J]. 方锐,畅飞,孙照霖,李宁,孟庆勇. 生物化学与生物物理进展. 2013(08)
[5]植物抗坏血酸过氧化物酶的表达调控以及对非生物胁迫的耐受作用[J]. 李泽琴,李静晓,张根发. 遗传. 2013(01)
[6]大力发展转基因作物[J]. 张启发. 华中农业大学学报(社会科学版). 2010(01)
[7]植物叶绿素合成、分解代谢及信号调控[J]. 史典义,刘忠香,金危危. 遗传. 2009(07)
[8]利用人U6 snRNA启动子构建RNA干扰质粒载体[J]. 楚莉辉,刘龙丁,马绍辉,王丽春,李琦涵. 中国生物化学与分子生物学报. 2006(03)
[9]利用番茄U3snRNA基因上游启动区构建植物表达载体及对烟草的转化[J]. 李丽莉,扈廷茂,扈会平,刘明秋,苏慧敏. 内蒙古大学学报(自然科学版). 2005(01)
硕士论文
[1]发根农杆菌诱导大豆毛状根体系的建立与应用[D]. 宗晓秋.中国农业科学院 2012
本文编号：3583590
【文章来源】：南京农业大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：161 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１－１人工设计的核酸酶编辑基因组的修复结果（Ｋｉｍ?ａｎｄ?Ｋｉｍ?２０１４）??Ｆｉｇ．?１－１?Ｏｕｔｃｏｍｅ?ｏｆ?ｇｅｎｏｍｅ?ｅｄｉｔｉｎｇ?ｕｓｉｎｇ?ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ?ｎｕｃｌｅａｓｅｓ??
ｒｅｐｅａｔｓ?（ＣＲＩＳＰＲ）?／ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ?（Ｃａｓ）?９。ＺＦＮｓ、ＴＡＬＥＮｓ?和?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ是研究比较多的，现在普遍采用的是后两种技术，特别是ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术。??Ｕ归巢核酸内切酶??归巢核酸内切酶（ＨｏｍｉｎｇＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）是最早用于基因打粑的工具酶，能够别长度为１４？４０ｂｐ的核甘酸序列，故又名大范围核酸酶（ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅｓ）?（Ｓｔｏｄｄａ２０１１；?Ｂｅｌｆｏｒｔ?ａｎｄ?Ｂｏｎｏｃｏｒａ?２０１４）。归巢核酸内切酶是由嵌入在内含子（ｇｒｏｕｐ?Ｉ、ｇｒｏｕＩＩ和ａｒｃｈａｅｌ类内含子）里的ＯＲＦ编码，或者是由内含肽切割产生的内切酶，能够使内含子在ＤＮＡ水平上的移动。归巢核酸内切酶识别的序列被称为归巢位点，由含子间或内含子侧翼的ＤＮＡ片段组成，内切酶识别并切割同源等位基因中非内含区域的归巢位点，然后利用修复机制插入内含子（Ｓｔｏｄｄａｒｄ２００５）。目前ＬＡＧＬＩＤＡＤ归巢核酸酶家族在基因打靶中使用最多，其包含一个或两个ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ片段的贝。含有两个ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ片段拷贝的酶被１００个左右氨基酸残基分隔开，以单的形式发挥作用，如Ｉ－Ｄｍｏｌ和Ｉ－Ｓｃｅｌ等；只有一个ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ片段拷贝的酶可形成同型二聚体后识别具有回文结构的归巢位点，包括Ｉ－Ｃｒｅｌ和Ｉ－ＣｅｕＩ等（图１－２）Ｉｎｒｎａｌｌｓｍｍｅｒｉｃｍｏｎｏｍｅｒ??
２个互补的ＺＦＮｓ在靶位点分别通过锌指结构以尾对尾的方式识别５’一３＇和３＇—５’的??ＤＮＡ链，然后２个ＦｏｋＩ核酸酶形成二聚体，激活内切酶活性来切割靶位点，产生双??链缺口（ＤＳＢｓ），从而诱发ＤＮＡ损伤修复机制（图１－３）。２个ＺＦＮ就可以在基因??组中特异性地结合１８？２４ｂｐ长度的序列。目前识别每一种三联碱基的６４种锌指组合??中己有大部分被发现并编撰成目录。针对每一条需要识别的目标序列（打靶位点），??我们都可以使用与密码子对应的类似方式对锌指结构进行模块化组装（ｍｏｄｕｌａｒ??ａｓｓｅｍｂｌｙ），从而获得能够识另Ｕ特定ＤＮＡ序歹Ｕ的锌指蛋白结构。??（Ｑ?１?Ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ?ｍｏｔｉｆ?ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ?Ｉ?ｈ??Ｋ?｝?ＣＸ“ＣＸ，ＦＩＸ，ＨＸ，Ｈ?Ｕ??；；Ｒｉｇｈｔ?ＺＦＰ?（??ｌｅｆｔ?ＺＦＰ??图１－３锌指核酸酶设计的结构示意图（Ｋｉｍ?ａｎｄ?Ｋｉｍ?２０１４）??Ｆｉｇ．?１－３?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｄｅｓｉｇｎｅｄ?ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ??（ａ）锌指的原理示意图；（ｂ）锌指结合ＤＮＡ的计算机模型。??（ａ）?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ?ｏｆ?ａ?ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ?ｎｕｃｌｅａｓｅ?（ＺＦＮ）?ｐａｉｒ；?（ｂ）?Ｃｏｍｐｕｔｅｒ?ｍｏｄｅｌ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ａ?ＺＦＮ?ｐａｉｒ??ｂｏｕｎｄ?ｔｏ?ＤＮＡ．??第一个锌指核酸酶是由约翰霍普金斯大学Ｃｈａｎｄｒａ实验室设计（Ｋｉｍ?ｅｔ?ａｌ．?１９９６），??该酶使用３个锌指结构域连接一个Ｆｏｋ?Ｉ核酸酶的催化活性功能域
【参考文献】：
期刊论文
[1]大豆转基因研究进展[J]. 姚丙晨,闫双勇,苏京平,马忠友,王晓静,孙玥,刘学军. 大豆科技. 2015(05)
[2]商业化转基因大豆育种研发进展与展望[J]. 高初蕾,乔峰,安怡昕,赵团结,孔杰杰. 分子植物育种. 2015(06)
[3]小菜蛾U6 snRNA基因的克隆及作为miRNA定量表达分析内参基因的评价[J]. 封冰,梁沛,高希武. 昆虫学报. 2014(03)
[4]CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术[J]. 方锐,畅飞,孙照霖,李宁,孟庆勇. 生物化学与生物物理进展. 2013(08)
[5]植物抗坏血酸过氧化物酶的表达调控以及对非生物胁迫的耐受作用[J]. 李泽琴,李静晓,张根发. 遗传. 2013(01)
[6]大力发展转基因作物[J]. 张启发. 华中农业大学学报(社会科学版). 2010(01)
[7]植物叶绿素合成、分解代谢及信号调控[J]. 史典义,刘忠香,金危危. 遗传. 2009(07)
[8]利用人U6 snRNA启动子构建RNA干扰质粒载体[J]. 楚莉辉,刘龙丁,马绍辉,王丽春,李琦涵. 中国生物化学与分子生物学报. 2006(03)
[9]利用番茄U3snRNA基因上游启动区构建植物表达载体及对烟草的转化[J]. 李丽莉,扈廷茂,扈会平,刘明秋,苏慧敏. 内蒙古大学学报(自然科学版). 2005(01)
硕士论文
[1]发根农杆菌诱导大豆毛状根体系的建立与应用[D]. 宗晓秋.中国农业科学院 2012
本文编号：3583590
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