棉花显性无腺体基因Gl 2 e 的克隆鉴定与作用机制分析

发布时间：2023-01-09 11:29

　　棉花是重要的战略资源,也是世界上最重要的经济作物之一。棉纤维是纺织工业优良的天然原料,而棉籽则是重要的营养资源。普通栽培棉的植株和种子都含有色素腺体,其中包含的有毒棉酚使棉籽脂肪和蛋白质等营养物质不能被充分利用。但是,棉酚的毒性能帮助棉花抵抗多种病虫害,对棉花的正常生长有重要作用。因此,选育植株有棉酚而种子无棉酚的棉花品种是低酚棉育种的主要目标。色素腺体的数量与棉酚的含量有密切联系,所以,克隆鉴定色素腺体发生的相关基因、探索腺体形成的分子机制一直是低酚棉育种的重要研究方向。单显性基因Gl₂^e可以调控无腺体性状的形成,是低酚棉育种的重要基因资源,并且对研究色素腺体的发生机制具有重要意义。本研究主要包括两方面内容:一是在精细定位的基础上对Gl₂^e候选基因进行克隆和功能验证;二是通过对7个腺体相关材料进行小RNA测序,分析差异表达的miRNA及其靶基因,探索腺体发生过程可能涉及的miRNA和信号通路。主要结果如下:1、根据已有结果,Gl₂^e基因被精细定位在12号... 

【文章页数】：102 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
1 文献综述
    1.1 棉花色素腺体和棉酚
        1.1.1 棉花色素腺体性状
        1.1.2 棉酚的特性
        1.1.3 色素腺体与棉酚的关系
        1.1.4 色素腺体研究的重要性
    1.2 色素腺体性状的遗传研究
        1.2.1 色素腺体相关的控制基因
        1.2.2 色素腺体相关的复等位基因
    1.3 显性无腺体基因Gl_2~e的研究
        1.3.1 Gl_2~e基因的发现与遗传分析
        1.3.2 Gl_2~e基因的研究进展
    1.4 棉酚生物合成途径及相关基因的研究
        1.4.1 棉酚的生物合成途径
        1.4.2 棉酚生物合成途径中主要基因的研究
    1.5 色素腺体相关材料的组学研究
    1.6 低酚棉育种进展
    1.7 植物MYC转录因子研究进展
        1.7.1 MYC1的研究
        1.7.2 MYC2的研究
        1.7.3 MYC3和MYC4的研究
    1.8 研究目的与意义
2 材料与方法
    2.1 实验仪器
    2.2 实验材料
    2.3 候选基因的确定
    2.4 候选基因序列分析
        2.4.1 RNA的提取
        2.4.2 反转录cDNA
        2.4.3 候选基因的扩增
        2.4.4 扩增产物的纯化
        2.4.5 TA克隆
        2.4.6 转化
        2.4.7 重组子检测与测序分析
    2.5 基因表达量分析
        2.5.1 RNA提取与反转录
        2.5.2 荧光定量PCR（qRT-PCR）
    2.6 启动子分析
        2.6.1 棉花DNA提取
        2.6.2 启动子序列和顺式作用元件分析
        2.6.3 启动子甲基化分析
    2.7 亚细胞定位
        2.7.1 Gl_2~e基因融合表达载体构建
        2.7.2 冻融法转化农杆菌LBA4404
        2.7.3 洋葱表皮细胞瞬时表达
    2.8 酵母中转录激活活性分析
        2.8.1 酵母表达载体构建
        2.8.2 酵母感受态的制备
        2.8.3 PEG/LiAc法转化酵母
    2.9 病毒诱导的基因沉默（VIGS）
        2.9.1 病毒表达载体构建
        2.9.2 VIGS实验
    2.10 棉花的遗传转化
    2.11 小RNA测序与数据分析
        2.11.1 RNA样品制备
        2.11.2 Total RNA质量检测与文库构建
        2.11.3 测序数据预处理
        2.11.4 已知miRNA分析
        2.11.5 新miRNA预测
        2.11.6 miRNA差异表达分析
        2.11.7 miRNA靶基因预测与功能富集分析
        2.11.8 miRNA及靶基因的qRT-PCR验证
    2.12 亚洲棉、雷蒙德氏棉和陆地棉中MYC蛋白的鉴定与分析
3 结果与分析
    3.1 Gl_2~e基因的图位克隆与候选基因分析
        3.1.1 Gl_2~e基因的精细定位与候选基因确认
        3.1.2 GhMYC2基因序列分析
        3.1.3 GhMYC2基因表达分析
    3.2 GhMYC2基因启动子分析
        3.2.1 启动子序列分析
        3.2.2 启动子顺式作用元件分析
        3.2.3 启动子甲基化分析
    3.3 GhMYC2转录因子亚细胞定位
    3.4 GhMYC2转录因子激活活性分析
        3.4.1 转录激活活性验证
        3.4.2 转录激活活性区分析
    3.5 GhMYC2转录因子功能验证
        3.5.1 病毒诱导的基因沉默
        3.5.2 棉花的遗传转化
    3.6 腺体相关材料miRNA分析
        3.6.1 小RNA测序数据统计
        3.6.2 已知miRNA和新的miRNA分析
        3.6.3 差异表达miRNA分析
        3.6.4 差异表达miRNA靶基因预测
        3.6.5 差异表达miRNA的靶基因GO和KEGG分析
        3.6.6 miRNA和靶基因的表达量验证
    3.7 棉花MYC蛋白的鉴定与进化分析
4 结论与讨论
    4.1 Gl_2~e候选基因的确定
    4.2 GhMYC2基因的表达
    4.3 GhMYC2基因的功能验证
    4.4 GhMYC2作用机制推测
    4.5 GhMYC2基因在低酚棉育种中的应用
    4.6 腺体相关材料小RNA分析
    4.7 小RNA靶基因分析
    4.8 研究展望
    4.9 全文结论
参考文献
致谢
附录


【参考文献】：
期刊论文
[1]棉酚及其衍生物合成途径的研究进展[J]. 张程程,吴燕民,唐益雄.  生物技术进展. 2011(03)
[2]陆地棉突变体腺体形成时期的基因表达谱[J]. 陈敏,江明锋,蔡应繁,孙全,何晓红,江怀仲,谢永芳,莫剑川,高运玲,潘正,陈珺,伍婷玉,王玲,朱小燕,张锐,袁友禄,石玉真.  江苏农业学报. 2010(03)
[3]棉花色素腺体研究进展[J]. 邱志坚,刘文哲.  鲁东大学学报(自然科学版). 2008(02)
[4]棉花棉酚含量与抗虫特性的研究[J]. 刘泽辉,赵国虎,陆敬善,水涌,武刚.  新疆农业科学. 2008(03)
[5]Fine mapping of the dominant glandless Gene Gl2e in Sea-island cotton （Gossypium barbadense L.）[J]. DONG ChengGuang,DING YeZhang,GUO WangZhen ＆ ZHANG TianZhen National Key Laboratory of Crop Genetics ＆ Germplasm Enhancement,Cotton Research Institute,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China.  Chinese Science Bulletin. 2007(22)
[6]植物萜类化合物的天然合成途径及其相关合酶[J]. 张长波,孙红霞,巩中军,祝增荣.  植物生理学通讯. 2007(04)
[7]我国陆地棉品种性状分析[J]. 黄滋康.  中国棉花. 2006(09)
[8]陆地棉子叶色素腺体延缓形成种质系的育成及其遗传研究[J]. 祝水金,蒋玉蓉,N.Reddy,季道藩.  科学通报. 2004(19)
[9]棉酚腺体与棉酚生物合成及低酚棉分子育种[J]. 朱美霞,李永起,戴小枫.  分子植物育种. 2004(03)
[10]棉籽饼粕脱毒方法研究进展[J]. 王红云,高占峰,付才.  河北农业科学. 2004(01)

博士论文
[1]棉花茎秆无腺体基因gl1的精细定位及棉酚腺体发育相关基因筛选[D]. 陆才瑞.华中农业大学 2016
[2]棉花T-DNA激活标签突变体pag1分子机制的研究与应用[D]. 杨作仁.中国农业科学院 2014
[3]棉属（Gossypium）特殊腺体发育相关基因和棉酚合成关键酶基因的克隆及棉酚的分析[D]. 蔡应繁.四川大学 2003

硕士论文
[1]棉花显性无腺体基因Gl2e的精细定位与克隆[D]. 程海亮.中国农业科学院 2014
[2]棉花显性无腺体基因Gl2e的精细定位[D]. 黄娟.河南大学 2012
[3]海岛棉显性无腺体基因Gl2～e的精细定位[D]. 董承光.南京农业大学 2007
[4]陆地棉显性无腺体基因Gl2～e的分子标记[D]. 蒋小燕.中国农业科学院 2002



本文编号：3729107