抗鳞翅目和鞘翅目害虫转基因水稻培育

发布时间：2023-01-11 05:19

　　水稻是世界上主要的粮食作物之一。虫害是造成水稻产量损失的主要原因之一。稻纵卷叶螟（Cnaphalocrocis medinalis）、二化螟（Chilo suppressalis）和三化螟（Tryporyza incertulas）是水稻生产中主要的鳞翅目害虫。已有大量研究报道转Bt基因水稻可以有效的控制鳞翅目害虫。目前培育的转基因水稻大多带有筛选标记基因,而筛选标记的存在会带来诸多不利影响。本研究利用农杆菌介导的双质粒双菌株法将cry1C*基因、cry2A*基因分别与hpt基因一起转化优良籼稻恢复系明恢86（MH86）,然后通过转基因植株的自交分离分别获得无标记的cry1C*与cry2A抗鳞翅目害虫水稻。除此以外,鞘翅目的稻水象甲（Lissorhoptrus oryzophilus）是田间危害水稻的又一类害虫。有研究报道Cry3类Bt蛋白对鞘翅目昆虫有毒杀作用,本研究把人工优化合成的cry3Aa*与cry3Bb*分别转化粳稻品种中花11（ZH11）,期望培育出抗鞘翅目害虫的转基因水稻。本研究取得的主要结果如下:1.通过PCR检测以及SouthernBlotting检测,在pMF-1C... 

【文章页数】：117 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
缩略语表
第一章 文献综述
    1 研究问题的由来
    2 Bt基因简介
    3 无标记转基因植物的培育策略
        3.1 共转化法
            3.1.1 双质粒双菌株法
            3.1.2 双质粒单菌株法
            3.1.3 双T-DNA区单质粒法
        3.2 位点特异性重组法
            3.2.1 Cre/LoxP系统
            3.2.2 FLP/Frt系统
            3.2.3 R/Rs系统
        3.3 转座子系统
        3.4 MAT载体系统
        3.5 同源重组
        3.6 PCR法
    4 抗鳞翅目害虫转基因水稻研究进展
        4.1 一个接近商业化的抗虫水稻品系:华恢1号
        4.2 转新型Bt基因抗虫水稻的培育
        4.3 双价Bt抗虫水稻的培育
        4.4 组织特异性表达的Bt抗虫水稻
    5 抗鞘翅目害虫转基因植物研究进展
        5.1 对鞘翅目昆虫有效毒杀的Bt菌株及基因
        5.2 抗鞘翅目害虫的转基因植物
            5.2.1 转cry3A类基因的植物
            5.2.2 转cry3B类基因的植物
            5.2.3 其他类抗鞘翅目害虫的转Bt基因植物
    6 转基因水稻安全性研究现状
        6.1 食用安全性
        6.2 环境安全性
            6.2.1 对非靶标昆虫的影响
            6.2.2 Bt水稻对根系生态系统的影响
        6.3 小结
    7 本研究的目的与意义
第二章 无标记抗鳞翅目害虫水稻的培育
    1 试验材料
        1.1 载体与菌株
        1.2 Bt抗虫基因
        1.3 水稻品种
        1.4 供试昆虫
    2 试验方法
        2.1 技术路线
        2.2 无标记转化载体构建
        2.3 遗传转化
        2.4 水稻叶片DNA的少量抽提
        2.5 PCR阳性检测
        2.6 植物总DNA大量抽提
        2.7 Southern Blotting
        2.8 无标记纯合后代筛选
        2.9 田间杂交
        2.10 Bt蛋白含量测定
            2.10.1 ELISA反应(以Cry1C蛋白为例)
            2.10.2 酶标仪测定Bt蛋白浓度
        2.11 室内接虫试验
        2.12 田间抗虫性试验
        2.13 农艺性状考查
        2.14 侧翼序列分离
        2.15 回交与双价聚合材料的后代纯合株系筛选
    3 结果与分析
        3.1 遗传转化与DNA分子检测
        3.2 纯合株系及相应的杂交种中Bt蛋白含量测定
            3.2.1 Cry1C蛋白含量测定
            3.2.2 Cry2A蛋白含量测定
        3.3 转基因材料的室内接虫试验
            3.3.1 cy1C~*转基因材料室内对一龄二化螟及三化螟的抗性
            3.3.2 cry2A~*转基因材料室内对一龄二化螟及三化螟的抗性
        3.4 转基因材料的田间抗虫性
        3.5 转基因材料田间农艺性状考查
        3.6 转基因材料中T-DNA的侧翼序列信息
            3.6.1 株系1CH1-2中T-DNA的侧翼序列信息
            3.6.2 株系8-30中T-DNA的侧翼序列信息
        3.7 回交材料的纯合筛选
        3.8 回交材料的田间农艺性状考查
第三章 抗鞘翅目害虫水稻的培育
    1 试验材料
        1.1 载体及菌株
        1.2 Bt抗虫基因
        1.3 水稻材料
        1.4 供试昆虫
    2 试验方法
        2.1 技术路线
        2.2 载体构建
            2.2.1 双T-DNA载体的改造
            2.2.2 表达载体的构建
        2.3 遗传转化
        2.4 水稻叶片DNA的少量抽提
        2.5 水稻叶片RNA的抽提
        2.6 RNA的反转录
        2.7 PCR检测
        2.8 T_0代植株的Southern Blotting检测
        2.9 单拷贝纯合株系筛选
        2.10 转基因纯合株系室内对稻水象甲的抗性测定
            2.10.1 取食斑调查试验
            2.10.2 死亡率调查试验
                2.10.2.1 分蘖期植株接虫试验
                2.10.2.2 幼苗期植株接虫试验
        2.11 抗虫数据处理与分析
    3 结果与分析
        3.1 遗传转化
        3.2 T_0代转基因植株的Southern Blotting检测
        3.3 T_0代转基因植株的表达量检测
            3.3.1 T_0代转基因植株的RT-PCR检测
            3.3.2 T_0代转基因植株的qRT-PCR检测
        3.4 转基因植株的纯合株系筛选
        3.5 转基因纯合株系对稻水象甲的抗性
            3.5.1 取食斑总数与累计长度调查
            3.5.2 转基因植株对稻水象甲成虫的抗性
第四章 讨论
    1 无标记转基因材料的Bt蛋白含量
    2 不同螟虫对Bt蛋白的敏感性差异
    3 转基因材料的农艺性状
    4 转cry1C~*与cry2A~*无标记材料的应用前景
    5 无标记转基因材料的优点及pDT载体的应用
    6 稻水象甲抗性测定方法的思考
参考文献
附录Ⅰ 载体图
附录Ⅱ Tail-PCR反应体系及程序
附录Ⅲ 组织培养试剂配制与培养基配方
    2.1 相关试剂配制
    2.2 籼稻遗传转化培养基配方
    2.3 粳稻遗传转化培养基配方
附录Ⅳ 个人简介
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]转Bt水稻土壤跳虫群落组成及其数量变化[J]. 祝向钰,李志毅,常亮,袁一扬,戈峰,吴刚,陈法军.  生态学报. 2012(11)
[2]连续回交对消除农杆菌介导转化引起水稻体细胞变异的影响[J]. 杨宙,陈浩,唐微,林拥军.  作物学报. 2012(05)
[3]根癌农杆菌介导mBt886Cry3Aa转化菊花及对菊天牛毒杀作用[J]. 王沛,周洲,苏丽娟,尹新明.  中国农业科学. 2011(14)
[4]两株杀鞘翅目害虫Bt菌株的生物活性及杀虫蛋白基因鉴定[J]. 初立良,郑桂玲,周洪旭,李长友,李国勋.  华北农学报. 2010(03)
[5]转基因水稻研发进展[J]. 朱祯.  中国农业科技导报. 2010(02)
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[7]Rapid Generation of Selectable Marker-Free Transgenic Rice with Three Target Genes by Co-Transformation and Anther Culture[J]. ZHU Li1, FU Ya-ping1, LIU Wen-zhen1, HU Guo-cheng1, SI Hua-min1, TANG Ke-xuan2, SUN Zong-xiu1 (1 State Key Laboratory of Rice Biology, China National Rice Research Institute, Hangzhou 310006, China; 2 Plant Biotechnology Research Center, School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200030, China; These authors contributed equally to this paper).  Rice Science. 2007(04)
[8]利用双T-DNA载体系统培育无选择标记转基因大豆[J]. 张秀春,彭明,吴坤鑫,郭丽琼,林俊扬,林俊芳.  大豆科学. 2006(04)
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博士论文
[1]Bt抗虫水稻的培育[D]. 唐微.华中农业大学 2006
[2]三种Bt基因（cry1Ac、cry2A～*和cry9C～*）抗虫水稻的培育及评价[D]. 陈浩.华中农业大学 2005

硕士论文
[1]发根农杆菌介导的Bt基因Cry8e转化大豆抗蛴螬研究[D]. 刘艳菊.河南师范大学 2010
[2]转抗虫基因（BtCry3A）741杨抗虫性研究[D]. 李静.河北农业大学 2006
[3]抗鞘翅目Bt杀虫基因GFMcry3Bb的人工合成、原核表达及植物转基因的研究[D]. 陈孝平.华中农业大学 2004
[4]Bt杀虫基因双价植物表达载体的构建及抗虫马铃薯植株的获得[D]. 蒋红玲.中国农业科学院 2001



本文编号：3729478