高氮条件下microRNA528调控玉米倒伏的机制研究

发布时间：2023-05-08 02:31

　　为了获得高产,农民往往过量施用氮肥。氮肥的大量使用,不仅导致氮肥利用效率降低、环境污染等,还容易引起作物倒伏,但其中的机制有待于破解。实验室前期对缺氮处理的玉米幼苗组成的小RNA文库进行测序,发现ZmmiR528能够响应氮胁迫。miR528是特定单子叶植物所特有的,虽有研究表明miR528在水稻中通过作用于L-抗坏血酸氧化酶参与病原菌免疫反应,但miR528在玉米中的靶基因与水稻明显不同,暗示miR528在玉米中有不同功能。因此,本论文通过分子生物学、细胞生物学等技术手段,深入研究miR528在玉米中的功能。主要实验结果如下:1、通过硫代酸解法和乙酰溴法对不同氮处理条件下玉米苗期木质素组成和含量进行测定,我们发现在高氮条件下,地上部产生的p-香豆醇H、松柏醇G和芥子醇S单体减少,S/G比值降低,木质素总含量降低;而在低氮条件下,产生的H、G和S单体增加,S/G比值升高,木质素总含量增加。2、Stem-loop RT-qPCR结果显示,在高氮条件下,ZmmiR528上调表达,而在低氮条件下,ZmmiR528下调表达,与木质素对氮响应恰好相反。3、对ZmmiR528的预测靶基因进行定量,在...

【文章页数】：87 页

【学位级别】：博士

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摘要
abstract
英文缩略表
第一章 引言
    1.1 我国氮肥使用现状
    1.2 倒伏的类型、原因及危害
        1.2.1 植株倒伏的类型
        1.2.2 影响倒伏的因素
        1.2.3 倒伏带来的危害
    1.3 木质素的生物合成
        1.3.1 木质素合成的代谢途径
        1.3.2 木质素的合成受转录因子调控
        1.3.3 木质素的合成受miRNA调控
    1.4 植物miRNA参与氮胁迫过程
        1.4.1 miRNA能够改变根的生长发育
        1.4.2 miRNA参与氮素吸收
        1.4.3 miRNA参与次生代谢产物产生和自由基清除过程
        1.4.4 玉米中参与氮胁迫的miRNA
    1.5 植物miR528研究进展
    1.6 立题依据和技术路线
        1.6.1 立题依据
        1.6.2 创新点和技术路线
第二章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株及载体
        2.1.3 酶、试剂盒与生化试剂
        2.1.4 实验所用引物及探针
    2.2 实验方法
        2.2.1 植物培养
        2.2.2 总RNA的提取
        2.2.3 cDNA第一链的合成
        2.2.4 PCR扩增目的基因
        2.2.5 In-Fusion反应构建载体
        2.2.6 烟草瞬时表达
        2.2.7 5′-RACE
        2.2.8 Stem-loopRT-qPCR
        2.2.9 荧光定量PCR
        2.2.10 小RNA的提取
        2.2.11 小RNA探针的标记及效率检测
        2.2.12 小RNA的分离及杂交
        2.2.13 植物材料的固定包埋及石蜡切片的制备
        2.2.14 原位杂交
        2.2.15 木质素染色
        2.2.16 木质素含量测定
        2.2.17 纤维素含量测定
        2.2.18 半纤维素含量测定
        2.2.19 茎杆穿刺强度测定
        2.2.20 转录组测序
        2.2.21 His融合蛋白的原核诱导表达及纯化
        2.2.22 凝胶阻滞迁移实验
        2.2.23 酵母单杂交
第三章 结果与分析
    3.1 氮素影响玉米苗期木质素组成和含量
    3.2 ZmmiR528受氮调控
    3.3 ZmLAC3和ZmLAC5是ZmmiR528的靶基因
    3.4 ZmmiR528和ZmLACs主要在维管组织中表达
        3.4.1 实时定量PCR检测ZmmiR528和ZmLACs的空间表达部位
        3.4.2 原位杂交检测ZmmiR528和ZmLAC5的组织表达部位
    3.5 高氮条件下ZmmiR528影响玉米倒伏性
        3.5.1 玉米ZmmiR528转基因植株的构建
        3.5.2 ZmmiR528影响玉米苗期体内木质素含量
        3.5.3 ZmmiR528影响玉米成熟期倒伏性
    3.6 过表达ZmLAC3能够增加玉米体内木质素含量
        3.6.1 玉米ZmLAC3转基因植株的构建
        3.6.2 过表达ZmLAC3增加玉米木质素含量
    3.7 ZmmiR528和氮水平影响ZmPALs基因表达
        3.7.1 ZmmiR528敲减植株转录组测序
        3.7.2 ZmPALs基因受ZmmiR528和氮调控
    3.8 ZmTGA4能够调控ZmmiR528b参与氮胁迫过程
        3.8.1 ZmTGA4在酵母中的转录激活活性分析
        3.8.2 EMSA验证ZmTGA4能够结合ZmmiR528b启动子
第四章 讨论
    1、氮素影响玉米苗期木质素组成和含量
    2、Zmmi R528 受氮供应水平调控
    3、ZmLAC3 和 ZmLAC5 是 ZmmiR528 的靶基因
    4、ZmmiR528 通过 ZmLACs 影响 ZmPALs 的表达，参与调节氮循环及木质素合成过程，进而影响高氮条件下玉米倒伏性
    5、木质素生物合成过程中的转录后调控在单子叶和双子叶植物中是保守的
    6、ZmmiR528 过表达玉米可用于生物能源的原材料
第五章 全文结论
参考文献
附录
致谢
作者简历



本文编号：3811806