大豆组织特异型启动子表达特性分析
发布时间：2023-08-09 17:12
大豆是重要的粮油兼用作物,世界各地均有种植。大豆种子中含有丰富的脂肪、植物蛋白以及营养物质。但是大豆的生长环境使其经常面临病原体、害虫等生物胁迫和高温、干旱等非生物胁迫的侵害,生长发育受到严重影响,从而导致大豆产量下降和品质恶化,因此需要有效且经济的方法来改良大豆品种。大豆的基因组比较大,调控基因表达的机制复杂,随着越来越多的抗病基因被发现,对启动子等基因表达调控元件的研究也刻不容缓。但是目前转基因技术常用的启动子大多为组成型表达的启动子,这可能在转基因植株中引起额外的代谢负担或毒性效应。因此,为了对基因的时空表达进行更深入的研究,就需要能够指导目的基因在特定的组织和器官中表达的组织特异型启动子。本研究通过已发表的大豆转录组数据筛选组织特异表达的基因,并在大豆全基因组信息数据库中查找基因上游的启动子序列,从大豆品种Williams 82中克隆启动子序列并构建了启动子驱动GUS基因的表达载体,通过农杆菌介导法侵染转化拟南芥得到阳性植株,并用GUS染色及RT-PCR验证启动子的表达模式。同时用转入了组织特异启动子GUS表达载体的发根农杆菌转化大豆,获得毛状根,用GUS染色验证启动子在大豆毛...
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
1 引言
1.1 研究背景
1.2 植物启动子概述
1.2.1 组成型启动子
1.2.2 诱导型启动子
1.2.3 组织特异型启动子
1.3 组织特异型启动子研究进展
1.3.1 植物启动子特异表达相关元件
1.3.2 根特异表达启动子
1.3.3 叶特异表达启动子
1.3.4 花特异表达启动子
1.3.5 种子特异表达启动子
1.4 启动子研究的方法
1.4.1 启动子的分离克隆方法
1.4.2 启动子的生物信息学分析
1.4.3 启动子表达模式的验证
1.5 发根农杆菌介导的大豆遗传转化
1.6 研究目的及意义
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 载体和菌株
2.1.3 实验试剂及培养基
2.2 实验方法
2.2.1 大豆基因组DNA的提取
2.2.2 大豆组织特异表达基因的筛选
2.2.3 RT-PCR验证大豆组织特异表达基因的表达模式
2.2.4 组织特异启动子的克隆
2.2.5 启动子GUS表达载体的构建
2.2.6 农杆菌侵染法转化拟南芥
2.2.7 拟南芥培养及转基因植株筛选
2.2.8 阳性植株的组织化学分析
2.2.9 GUS表达量RT-PCR检测
2.2.10 发根农杆菌介导的大豆遗传转化
2.2.11 大豆毛状根的组织化学染色
3 结果与分析
3.1 大豆组织特异表达基因的筛选
3.2 RT-PCR验证大豆组织特异表达基因的表达模式
3.3 组织特异启动子的克隆与载体构建
3.3.1 组织特异启动子的克隆
3.3.2 启动子GUS表达载体的构建
3.4 拟南芥转基因阳性植株的筛选
3.4.1 Basta筛选抗性植株
3.4.2 转基因阳性植株Bar试纸条检验
3.4.3 转基因T1代植株目的基因的检测
3.4.4 已获得的转基因阳性植株
3.5 拟南芥阳性植株组织化学分析(GUS染色)
3.5.1 叶特异启动子GUS染色结果
3.5.2 根特异启动子GUS染色结果
3.5.3 组成型启动子及野生型拟南芥GUS染色结果
3.6 拟南芥阳性植株GUS表达情况检测
3.6.1 拟南芥各组织RNA提取结果
3.6.2 叶特异启动子GUS表达情况检测
3.6.3 根特异启动子GUS表达情况检测
3.6.4 组成型启动子GUS表达情况检测
3.7 发根农杆菌侵染大豆及GUS染色鉴定
3.7.1 大豆毛状根的获得
3.7.2 发根诱导率及发根数
3.7.3 组织特异启动子GUS染色结果
3.7.4 GUS基因转化效率
3.8 组织特异启动子的生物信息学分析
4 讨论
5 结论
参考文献
致谢
本文编号：3840634
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
1 引言
1.1 研究背景
1.2 植物启动子概述
1.2.1 组成型启动子
1.2.2 诱导型启动子
1.2.3 组织特异型启动子
1.3 组织特异型启动子研究进展
1.3.1 植物启动子特异表达相关元件
1.3.2 根特异表达启动子
1.3.3 叶特异表达启动子
1.3.4 花特异表达启动子
1.3.5 种子特异表达启动子
1.4 启动子研究的方法
1.4.1 启动子的分离克隆方法
1.4.2 启动子的生物信息学分析
1.4.3 启动子表达模式的验证
1.5 发根农杆菌介导的大豆遗传转化
1.6 研究目的及意义
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 载体和菌株
2.1.3 实验试剂及培养基
2.2 实验方法
2.2.1 大豆基因组DNA的提取
2.2.2 大豆组织特异表达基因的筛选
2.2.3 RT-PCR验证大豆组织特异表达基因的表达模式
2.2.4 组织特异启动子的克隆
2.2.5 启动子GUS表达载体的构建
2.2.6 农杆菌侵染法转化拟南芥
2.2.7 拟南芥培养及转基因植株筛选
2.2.8 阳性植株的组织化学分析
2.2.9 GUS表达量RT-PCR检测
2.2.10 发根农杆菌介导的大豆遗传转化
2.2.11 大豆毛状根的组织化学染色
3 结果与分析
3.1 大豆组织特异表达基因的筛选
3.2 RT-PCR验证大豆组织特异表达基因的表达模式
3.3 组织特异启动子的克隆与载体构建
3.3.1 组织特异启动子的克隆
3.3.2 启动子GUS表达载体的构建
3.4 拟南芥转基因阳性植株的筛选
3.4.1 Basta筛选抗性植株
3.4.2 转基因阳性植株Bar试纸条检验
3.4.3 转基因T1代植株目的基因的检测
3.4.4 已获得的转基因阳性植株
3.5 拟南芥阳性植株组织化学分析(GUS染色)
3.5.1 叶特异启动子GUS染色结果
3.5.2 根特异启动子GUS染色结果
3.5.3 组成型启动子及野生型拟南芥GUS染色结果
3.6 拟南芥阳性植株GUS表达情况检测
3.6.1 拟南芥各组织RNA提取结果
3.6.2 叶特异启动子GUS表达情况检测
3.6.3 根特异启动子GUS表达情况检测
3.6.4 组成型启动子GUS表达情况检测
3.7 发根农杆菌侵染大豆及GUS染色鉴定
3.7.1 大豆毛状根的获得
3.7.2 发根诱导率及发根数
3.7.3 组织特异启动子GUS染色结果
3.7.4 GUS基因转化效率
3.8 组织特异启动子的生物信息学分析
4 讨论
5 结论
参考文献
致谢
本文编号：3840634
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/nzwlw/3840634.html
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