象草PpMYB4与CCR启动子的互作及对木质素合成的影响

发布时间：2023-10-07 19:12

　　象草(Pennisetum purpureum)是禾本科狼尾草属的多年生大型草本植物,是优良饲用牧草及新型能源植物。但其体内过高的木质素含量限制了象草的开发与利用。所以,利用基因工程的方法,降低象草木质素含量或改变木质素组成对象草的利用具有重要意义。MYB转录因子及肉桂酰辅酶A还原酶(Cinnamoy-CoA Reductase,CCR)基因启动子都参与了木质素的生物合成调控。本文研究了象草抑制型PpMYB4转录因子(登录号为:KU612217)与PpCCR启动子互作关系,以期为象草的木质化改良工作奠定基础。主要的研究结果如下:(1)构建了一个以LUC以及REN为报告基因的双荧光素酶报告检测PpCCRPro-LUC载体和PpMYB4-SK载体,通过瞬转烟草后测定荧光值发现PpMYB4与PpCCR启动子(PpCCRPro)有明显的互作,且能抑制了PpCCRPro的活性。(2)通过构建PpCCRPro启动GUS报告基因的表达载体PpCCRPro-GUS和pBA-PpMYB4载体,并瞬转烟草,测定GUS酶活发现,PpMYB4与PpCCRPro有明显的互作,且抑制了PpCCRPro的活性。(3...

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【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
英文缩写表
1 前言
    1.1 能源植物象草的研究进展
    1.2 木质素的基本结构
    1.3 木质素合成的调控
        1.3.1 木质素生物合成关键酶基因的调控
        1.3.2 环境因子及转录因子对木质素合成调控
    1.4 转录因子
        1.4.1 转录因子的结构特征
        1.4.2 转录因子MYB研究进展
        1.4.3 MYB对木质素合成的调控
    1.5 植物启动子与转录因子互作研究方法
        1.5.1 双荧光素酶报告基因检测
        1.5.2 瞬时表达分析
        1.5.3 EMSA实验
        1.5.4 染色质免疫共沉淀实验
    1.6 研究的目的及意义
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 菌种和质粒
        2.1.3 主要试剂、试剂盒及来源
        2.1.4 主要试剂配置
    2.2 方法
        2.2.1 PpMYB4-SK载体的构建
            2.2.1.1 目的片段的克隆
            2.2.1.2 PCR产物回收
            2.2.1.3 PCR产物的酶切与连接
            2.2.1.4 大肠杆菌Top10感受态制备
            2.2.1.5 重组载体的转化
            2.2.1.6 重组载体的菌落PCR鉴定
            2.2.1.7 质粒提取
            2.2.1.8 重组质粒双酶切的鉴定
        2.2.2 PpCCRPro-LUC载体的构建
            2.2.2.1 目的片段的克隆
            2.2.2.2 酶切、连接与转化
            2.2.2.3 重组质粒的鉴定
        2.2.3 双荧光双荧光素酶报告基因检测研究
            2.2.3.1 EHA105感受态制备
            2.2.3.2 冻融法转化农杆菌EHA105
            2.2.3.3 准备注射烟草叶片
            2.2.3.4 烟草叶片的注射
            2.2.3.5 检测烟草叶片相对荧光值
        2.2.4 瞬时表达载体的农杆菌转化
            2.2.4.1 EHA105感受态制备
            2.2.4.2 冻融法转化农杆菌EHA105
        2.2.5 瞬时表达分析
            2.2.5.1 准备烟草叶片注射
            2.2.5.2 烟草叶片的注射
            2.2.5.3 GUS酶活性测定
        2.2.6 凝胶迁移率实验（EMSA）
            2.2.6.1 PpMYB4表达载体的转化
            2.2.6.2 小量表达与鉴定
            2.2.6.3 蛋白大量表达及破菌检测
            2.2.6.4 包涵体蛋白纯化
            2.2.6.5 包涵体蛋白复性
            2.2.6.6 复性蛋白纯化
            2.2.6.7 DNA探针的设计
            2.2.6.8 DNA探针的标记
            2.2.6.9 生物素标记探针标记效率的检测
            2.2.6.10 EMSA胶的配制及EMSA结合反应
            2.2.6.11 电泳
            2.2.6.12 转膜及交联
            2.2.6.13 化学发光检测
        2.2.7 染色体免疫共沉淀（ChIP）实验载体的构建
            2.2.7.1 目的片段的克隆
            2.2.7.2 酶切、连接与转化
            2.2.7.3 重组子的鉴定
        2.2.8 烟草的遗传转化
            2.2.8.1 EHA105感受态制备
            2.2.8.2 冻融法转化农杆菌EHA105
            2.2.8.3 烟草叶盘法遗传转化
        2.2.9 转基因烟草的鉴定
            2.2.9.1 DNA提取
            2.2.9.2 PCR鉴定
            2.2.9.3 半定量RT-PCR鉴定
        2.2.10 ChIP实验
            2.2.10.1 组织固定及交联
            2.2.10.2 核酸分离及片段化
            2.2.10.3 预洗涤
            2.2.10.4 免疫沉淀
            2.2.10.5 反交联
            2.2.10.6 qPCR检测富集效率
            2.2.10.7 琼脂糖凝胶鉴定
        2.2.11 象草PpCCRPro-PpMYB4过表达载体的构建
            2.2.11.1 目的片段的克隆
            2.2.11.2 酶切、连接与转化
            2.2.11.3 重组子的鉴定
        2.2.12 烟草的遗传转化
            2.2.12.1 感受态EHA105的制备
            2.2.12.2 冻融法转化农杆菌EHA105
            2.2.12.3 烟草的叶盘法转化
        2.2.13 转基因烟草的鉴定
            2.2.13.1 DNA的提取以及PCR鉴定
        2.2.14 木质素含量的测定
            2.2.14.1 木质素标准曲线的绘制。
            2.2.14.2 木质素含量测定
        2.2.15 植物激素处理
        2.2.16 实时荧光定量PCR
            2.2.16.1 总RNA的提取及c DNA第一链合成
            2.2.16.2 qPCR实验
3 结果与分析
    3.1 双荧光素酶报告基因检测结果分析
        3.1.1 PpMYB4-SK载体的构建
        3.1.2 PpCCRPro-LUC载体的构建
        3.1.3 双荧光素酶报告基因检测互作分析
    3.2 瞬时表达研究分析
        3.2.1 瞬时表达载体农杆菌转化的鉴定
        3.2.2 瞬时表达GUS酶活性测定
    3.3 凝胶迁移率实验（EMSA）结果分析
        3.3.1 融合蛋白提取纯化结果
        3.3.2 探针标记效率结果
        3.3.3 EMSA检测结果
            3.3.3.1 PpMYB4蛋白和探针互作检测结果
            3.3.3.2 PpMYB4蛋白与探针PpCCR-2 竞争检测结果
    3.4 ChIP实验结果分析
        3.4.1 HA-pBA002-PpMYB4实验表达载体的构建
        3.4.2 HA-pBA002-PpMYB4转基因植株的PCR鉴定
        3.4.3 RT-PCR鉴定
        3.4.4 ChIP-PCR鉴定
    3.5 表达载体PpCCRPro-PpMYB4异源表达分析
        3.5.1 表达载体PpCCRPro-PpMYB4的构建
        3.5.2 转基因烟草PCR检测
        3.5.3 RT-PCR鉴定
        3.5.4 转基因植株表型及木质素含量的测定
        3.5.5 木质素合成相关基因的测定
        3.5.6 激素对木质素合成相关基因的影响
4 讨论
    4.1 PpCCRPro与PpMYB4转录因子互作研究
        4.1.1 双荧光素报告基因检测的研究
        4.1.2 瞬时表达分析研究
        4.1.3 凝胶迁移率实验（EMSA）研究
        4.1.4 染色质免疫共沉淀（ChIP）研究
    4.2 PpCCRPro-PpMYB4在烟草中过表达研究
5 结论
致谢
参考文献
附录A 引物表
附录B 标准曲线
附录C EMAS探针序列



本文编号：3852338