水稻野败型细胞质雄性不育恢复基因Rf4的分子机理研究

发布时间：2024-02-25 18:29

　　细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility,CMS)系统是作物杂种优势利用的遗传基础。目前,水稻(Oryza sativa L.)“三系”杂交稻的生产应用主要依赖于野败型(wild-abortive)细胞质雄性不育及恢复系统(CMS-WA/Rf)。研究表明,恢复基因Rf4编码一个P类PPR(pentatricopeptide repeat)蛋白,通过降解不育基因WA352 mRNA转录本而恢复育性,但RF4蛋白是如何结合WA352 mRNA并介导其降解的分子机理仍需进一步探究。本研究在前期克隆恢复基因Rf4的基础上,通过体外下拉实验(Pull-down assay)和质谱分析筛选得到RF4互作蛋白OsMUS81,并对其进行与RF4互作的验证,同时通过基因编辑对OsMUS81基因进行功能研究,获得如下结果:1)以RF4为诱饵通过体外下拉实验,获得与之互作的水稻蛋白复合体,并进行质谱鉴定,通过分析得到一个含有ERCC4结构域,具有核酸内切酶活性的互作蛋白OsMUS81。2)进一步利用一对一的酵母双杂实验、Pull-down实验以及BiFC实验技术证实了RF4与Os...

【文章页数】：54 页

【学位级别】：硕士

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摘要
abstract
1 前言
    1.1 研究背景
        1.1.1 高等植物的细胞质雄性不育
        1.1.2 水稻细胞质雄性不育的研究进展
        1.1.3 MUS81基因的研究进展
    1.2 本研究的目的和意义
    1.3 本研究的技术路线
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 水稻材料
        2.1.2 菌种与载体
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 主要仪器设备
    2.2 主要试剂配方
        2.2.1 常用试剂配方
        2.2.2 酵母双杂(Y2H)相关试剂
        2.2.3 原核表达及纯化相关试剂
        2.2.4 蛋白SDS-PAGE相关试剂
        2.2.5 Westernblot相关试剂
        2.2.6 原生质体转化相关试剂
        2.2.7 水稻组织培养相关试剂
    2.3 实验方法
        2.3.1 常规实验方法
            2.3.1.1 水稻DNA微量抽提法
            2.3.1.2 花粉育性观察
            2.3.1.3 常规载体构建
        2.3.2 蛋白Pull-down实验
            2.3.2.1 植物蛋白的抽提
            2.3.2.2 融合蛋白的原核诱导表达
            2.3.2.3 融合蛋白的体外结合
            2.3.2.4 融合蛋白与植物蛋白的半体外结合
            2.3.2.5 蛋白的Westernblot分析
        2.3.3 Y2H互作验证实验
        2.3.4 水稻样品RNA抽提、反转录及定量PCR实验
            2.3.4.1 水稻样品RNA的抽提
            2.3.4.2 RNA反转录实验
            2.3.4.3 定量PCR实验
        2.3.5 互作蛋白的亚细胞定位及荧光双分子互补(BiFC)实验
            2.3.5.1 瞬时表达载体的构建
            2.3.5.2 水稻原生质体转化
        2.3.6 CRISPR/Cas9双靶点敲除载体构建
        2.3.7 农杆菌介导的遗传转化
3 结果与分析
    3.1 RF4互作因子的筛选
        3.1.1 利用体外Pull-down实验筛选RF4的互作蛋白
        3.1.2 RF4互作蛋白的质谱分析
    3.2 RF4与OsMUS81的互作验证
        3.2.1 利用Y2H实验验证RF4与OsMUS81的互作
        3.2.2 利用Pull-down实验验证RF4与OsMUS81的互作
        3.2.3 利用BiFC实验验证RF4与OsMUS81的互作
    3.3 OsMUS81的功能研究
        3.3.1 OsMUS81的亚细胞定位
        3.3.2 OsMUS81的基因敲除及遗传分析
            3.3.2.1 OsMUS81的基因敲除
            3.3.2.2 T0敲除突变体突变位点的分子检测
            3.3.2.3 敲除突变体的表型观察
            3.3.2.4 敲除突变体中WA352的表达分析
4 讨论与结论
    4.1 讨论
    4.2 结论
致谢
参考文献



本文编号：3910714