基于发根技术解析大豆SOS1基因的耐盐功能

发布时间：2024-06-05 04:16

　　盐害是严重影响植物生长发育的非生物因素之一,土壤的盐渍化会使植物体内大量积累Na+,进而影响植物的生长、发育和产量。然而有些植物能在盐渍环境中正常生长,因此对其耐盐基因的研究有助于深入了解植物的耐盐机制,并用于提高植物的耐盐性。GmsSOS1是本课题组从栽培和野生大豆中克隆出的编码细胞质膜上Na+/H+离子逆向转运蛋白的基因。Nie等(2015)从野生大豆中克隆出GmsSOS1,并将GmsSOS1基因转入SOS1突变型的拟南芥突变体中进行回补实验,证明了GmsSOS1在拟南芥中表达能显著提高其耐盐性;Zhao等(2016)通过酵母互补实验证明GmsSOS1在酵母中表达可显著提高酵母的耐盐性。本实验主要通过发根技术将GmsSOS1基因在大豆发根(包括发根组合植株和子叶发根)中过表达,进一步验证GmsSOS1在耐盐性中的功能。将GmsSOS1基因构建到植物表达载体pCambia1304中,并通过发根农杆菌的介导将GmsSOS1转导至大豆细胞中,经PCR鉴定证明植物表达载体含有GmsSOS1的T-DNA区域已整合到大豆基因组中,GmsSOS1在CaMV35S启动子的作用下在发根中过表达。选取...

【文章页数】：97 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
缩略语
第一章 文献综述
    1 盐胁迫对植物的危害以及耐盐的主要机制
        1.1 盐胁迫对植物的影响
            1.1.1 离子毒害
            1.1.2 渗透胁迫与渗透调节
            1.1.3 氧化胁迫
            1.1.4 光合作用受阻
        1.2 植物耐盐的生理机制
            1.2.1 渗透调节
            1.2.2 营养离子平衡机制
            1.2.3 活性氧的清除机制
            1.2.4 激素调节机制
    2 高等植物耐盐相关基因研究进展
        2.1 渗透调节相关基因
        2.2 离子转运蛋白基因
        2.3 信号转导相关基因
    3 植物耐盐基因SOS1的研究进展
        3.1 质膜Na⁺/H⁺逆向转运基因SOS1分析
        3.2 高等植物SOS1的研究进展
        3.3 GmsSOS1基因及蛋白的生物信息学分析
    4 提高植物耐盐性的途径
    5 发根农杆菌的研究及其应用
        5.1 发根农杆菌及其Ri质粒
        5.2 发根农杆菌的应用
    6 本研究的目的和意义
第二章 GmsSOS1基因的克隆以及表达载体的构建
    1 材料与方法
        1.1 实验材料
            1.1.1 植物材料
            1.1.2 菌株和载体
            1.1.3 酶制剂及其他生化试剂
            1.1.4 实验引物
            1.1.5 实验仪器
            1.1.6 主要试剂的配制
        1.2 试验方法
            1.2.1 实验材料的培养
            1.2.2 大豆根部组织总RNA的提取
            1.2.3 总RNA完整性检测
            1.2.4 cDNA第一链的合成(RT-PCR)
            1.2.5 GmsSOS1基因全长的PCR克隆
            1.2.6 目的片段的回收
            1.2.7 质粒的提取
            1.2.8 大肠杆菌(DH5α)菌株感受态的制备
            1.2.9 目的片段和目的载体的双酶切
            1.2.10 连接产物的转化
    2 结果与分析
        2.1 大豆GmsSOS1基因全长的克隆及pCambia1304-SOS1载体的构建
            2.1.1 RNA提取
            2.1.2 大豆GmsSOS1基因CDS片段的克隆
            2.1.3 表达载体的构建
        2.2 大豆GmsSOS1基因的测序
    3 讨论
第三章 转GmsSOS1基因发根体系的建立
    1 材料与方法
        1.1 实验材料
            1.1.1 植物材料
            1.1.2 菌株和载体
            1.1.3 酶及其他生化制剂
            1.1.4 荧光定量PCR引物
            1.1.5 实验仪器
            1.1.6 缓冲液及主要溶液配制
        1.2 实验方法
            1.2.1 发根农杆菌(K599)感受态的制备
            1.2.2 目的载体的转化
            1.2.3 实验材料的培养以及盐处理
            1.2.4 发根基因组DNA的提取
            1.2.5 基因组中目的基因的检测
            1.2.6 荧光定量样品的获取
            1.2.7 荧光定量PCR实验数据的分析
    2 结果与分析
        2.1 发根中目的基因的鉴定
        2.2 荧光定量PCR反应
        2.3 盐胁迫下大豆GmsSOS1基因表达量的变化
    3 讨论
第四章 过表达GmsSOS1基因大豆发根组合植株耐盐性分析
    1 材料与方法
        1.1 实验材料
        1.2 试验方法
            1.2.1 大豆幼苗的培养
            1.2.2 发根组合苗的培养
            1.2.3 发根组合苗的盐处理
            1.2.4 幼苗根和叶相对电解质渗漏率的测定
            1.2.5 Na⁺、K⁺含量的测定
            1.2.6 叶绿素含量的测定
            1.2.7 真叶枯萎率的测定
            1.2.8 相对含水量的测定
            1.2.9 抗氧化酶活性的测定
    2 结果与分析
        2.1 大豆品系Lee68和N23674耐盐性比较
            2.1.1 大豆品系Lee68和N23674盐处理后形态特征
            2.1.2 大豆品系Lee68和N23674盐处理后真叶的相对含水量
            2.1.3 大豆品系Lee68和N23674盐处理后根和真叶的相对电导率
        2.2 大豆转基因发根组合植株的耐盐性探究
            2.2.1 NaCl处理对大豆组合植株表型的影响
            2.2.2 NaCl处理对大豆组合植株真叶相对含水量的影响
            2.2.3 NaCl处理对大豆组合植株根和叶片相对电导率的影响
            2.2.4 NaCl处理对大豆组合植株发根、茎、叶中离子含量的影响
            2.2.5 NaCl处理对大豆组合植株根和叶片抗氧化酶活性的影响
            2.2.6 NaCl处理对大豆组合植株叶绿素含量的影响
    3 讨论
第五章 过表达GmsSOS1基因大豆子叶发根耐盐性分析
    1 实验材料和方法
        1.1 实验材料
            1.1.1 植物材料
            1.1.2 菌液和载体
            1.1.3 酶制剂及其他生化试剂
            1.1.4 实验引物
            1.1.5 实验仪器
        1.2 实验方法
            1.2.1 发根农杆菌的转化
            1.2.2 大豆子叶的获取
            1.2.3 发根农杆菌的培养
            1.2.4 子叶发根的诱导、培养以及盐处理
    2 结果与分析
        2.1 子叶发根盐处理后表型的变化
        2.2 转GmsSOS1基因子叶发根目的基因的验证
        2.3 NaCl处理对转GmsSOS1子叶发根根长和根鲜重的影响
        2.4 NaCl处理对转GmsSOS1子叶发根Na⁺和K⁺含量的影响
    3 讨论
全文结论
创新性
存在的问题与展望
参考文献
致谢
硕士期间发表论文



本文编号：3989634