棉花GhCIPK6的功能鉴定及其参与调控植物糖稳态的机制解析
发布时间：2024-12-25 22:34
钙离子作为第二信使,在植物生长发育及对环境响应的过程中发挥了至关重要的作用。不同的环境条件及生理状态会引起植物体内产生不同的钙信号,而植物可以通过一系列钙离子感受器及下游蛋白来实现对钙信号的解码。已有研究表明,CBL-CIPK介导的钙信号转导参与了多种生物学过程,特别是对离子稳态的调控。然而由于CBL和CIPK家族成员在功能上的冗余,其众多潜在的功能还有待进一步发掘。糖作为植物最重要的代谢产物,其分配和利用受到严格的调控,但植物对糖稳态的精细调控机制还不是很清楚。本研究在棉花中鉴定到GhCBL2-GhCIPK6参与了植物对糖稳态的调控并对其机制进行了解析,结果如下:1.陆地棉GhCIPK家族的鉴定及表达分析本研究通过将拟南芥中的At CIPK蛋白序列与棉花参考基因组TM-1数据库进行比对,在棉花中共鉴定到79个GhCIPK成员并进行进化树分析。绝大多数GhCIPK在A亚基因组和D亚基因组中均存在对应的同源拷贝,其中A和D亚基因组中分别有4个成员属于GhCIPK6亚家族,而GhCIPK6A3/D3在整个家族叶片表达分析中具有最高表达量,在本研究中用GhCIPK6表示。此外,GhCIPK6被...
【文章页数】：137 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
1 前言
1.1 钙信号及其解码
1.1.1 钙信号产生的基础及特征
1.1.2 钙感受器与钙信号转导
1.2 CBL-CIPK研究进展
1.2.1 CBL-CIPK的由来及互作基础
1.2.2 CBL-CIPK参与调控植物离子稳态的研究
1.2.3 CBL-CIPK参与的其它生物学功能
1.3 植物中的糖转运子研究进展
1.3.1 单糖转运子参与的植物糖转运
1.3.2 蔗糖转运子参与的植物糖转运
1.3.3 SWEET转运子参与的植物糖转运
1.3.4 糖转运子的调控
1.4 本研究的目的与意义
2 材料方法
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 载体和菌株
2.2 实验方法
2.2.1 植物材料培养条件
2.2.2 基因家族进化分析及其在叶片中的表达量分析
2.2.3 载体构建及遗传转化
2.2.4 转基因植株阳性检测和拷贝数鉴定
2.2.5 基因表达量检测:RT-PCR,q RT-PCR和 Nothern杂交
2.2.6 可溶性糖和淀粉含量测定
2.2.7 磷酸化蛋白质组分析
2.2.8 转录组分析
2.2.9 酵母双杂交文库构建及筛选
2.2.10 病毒诱导的基因沉默实验(VIGS)
2.2.11 荧光素酶互补成像(LCI)分析
2.2.12 亚细胞定位
2.2.13 双荧光互补(BiFC)实验
2.2.14 蛋白原核表达和Pull-down实验
2.2.15 离子组分析
2.2.16 植物嫁接
2.2.17 基因编辑检测
2.2.18 植物饥饿及葡萄糖胁迫处理
2.2.19 缺素及不同营养水平处理
2.2.20 蒸腾及离体失水分析
2.2.21 水分利用效率分析
3 结果与分析
3.1 陆地棉GhCIPK家族蛋白鉴定及基因表达分析
3.1.1 GhCIPK家族蛋白鉴定和进化树分析
3.1.2 GhCIPK家族在叶片中的表达量及GhCIPK6 表达模式分析
3.2 GhCIPK6 转基因材料分子鉴定
3.2.1 从多拷贝GhCIPK6 超表达棉花中分离单拷贝植株
3.2.2 GhCIPK6 转基因超表达及RNAi棉花分子鉴定
3.2.3 GhCIPK6 敲除突变体阳性检测及突变序列分析
3.2.4 GhCIPK6 转基因超表达拟南芥阳性检测及表达量分析
3.3 GhCIPK6 负调控植物生长发育
3.3.1 GhCIPK6 转基因棉花表型分析
3.3.2 GhCIPK6 转基因拟南芥表型分析
3.4 GhCIPK6 正调控植物可溶性糖积累
3.4.1 GhCIPK6 转基因棉花成株期叶片糖含量分析
3.4.2 GhCIPK6 转基因棉花不同组织可溶性糖含量分析
3.4.3 GhCIPK6 促进棉花糖分积累随着植物的发育进程而增加
3.4.4 GhCIPK6 促进棉花糖分积累依赖GhCIPK6 的表达量
3.4.5 GhCIPK6 在促进棉花糖分积累中与同源基因存在功能冗余
3.4.6 GhCIPK6 调控糖分积累在不同物种中具有保守性
3.4.7 GhCIPK6 不影响糖酵解路径基因的表达
3.4.8 GhCIPK6 削弱了可溶性糖的长距离运输
3.5 GhCIPK6 正调控植株对饥饿及高浓度葡萄糖的耐性
3.6 酵母双杂交筛选GhCIPK6 互作靶标蛋白
3.6.1 酵母双杂交文库的构建及GhCIPK6 互作蛋白筛选
3.6.2 酵母双杂交候选互作蛋白VIGS功能验证
3.6.3 GhCBL家族分析及GhCIPK6-GhCBL点对点酵母双杂交筛选
3.6.4 VIGS对候选GhCBL进行功能验证
3.7 GhCBL2 参与了GhCIPK6 介导的可溶性糖积累
3.7.1 GhCBL2与GhCIPK6 体外互作
3.7.2 GhCBL2与GhCIPK6 体内互作并招募GhCIPK6 到液泡膜
3.7.3 GhCBL2超表达棉花阳性检测及表达量分析
3.7.4 GhCBL2敲除突变体序列分析
3.7.5 GhCBL2正调控棉花可溶性糖积累
3.7.6 GhCBL2 突变削弱了GhCIPK6 介导的葡萄糖积累
3.8 磷酸化蛋白质组学筛选GhCIPK6 潜在下游靶标
3.8.1 差异磷酸化蛋白分析
3.8.2 磷酸化候选蛋白VIGS功能验证
3.9 Gh TST2 参与了GhCIPK6 介导的可溶性糖积累
3.9.1 GhTST家族分析
3.9.2 Gh TST2与GhCIPK6 酵母双杂交及Pull-down分析
3.9.3 Gh TST2与GhCIPK6 Bi FC体内互作实验
3.9.4 棉花GhTST2超表达植株阳性检测及表达量分析
3.9.5 棉花GhTST2敲除突变体突变序列分析及表达量检测
3.9.6 拟南芥AtTST1/2敲除突变体创建及突变序列分析
3.9.7 GhTST2正调控棉花可溶性糖含量
3.9.8 Gh TST2 突变削弱了GhCIPK6 介导的棉花可溶性糖积累
3.9.9 At TST1/2 突变阻断了GhCIPK6 在拟南芥中介导的可溶性糖积累
3.10 GhCIPK6 的其他生物学功能
3.10.1 GhCIPK6 负调控植株矿质营养的含量
3.10.2 超表达GhCIPK6 加速离体条件下叶片失水速率
3.10.3 超表达GhCIPK6 降低植株蒸腾作用并提高水分利用效率
3.10.4 矿质元素与植物可溶性糖含量及蒸腾的关系
3.10.5 GhCIPK6 参与对糖含量和水分利用的调控是独立的
3.10.6 GhCIPK6 转基因材料转录组分析
4 讨论
4.1 GhCIPK6 参与调节植物糖稳态
4.2 GhCIPK6 调控糖稳态的路径存在功能冗余
4.3 糖在植物生长发育和逆境抗性中的作用
4.4 CIPK6功能多样性
参考文献
附录
攻读学位期间已发表和待发表的论文
致谢
本文编号：4020106
【文章页数】：137 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
1 前言
1.1 钙信号及其解码
1.1.1 钙信号产生的基础及特征
1.1.2 钙感受器与钙信号转导
1.2 CBL-CIPK研究进展
1.2.1 CBL-CIPK的由来及互作基础
1.2.2 CBL-CIPK参与调控植物离子稳态的研究
1.2.3 CBL-CIPK参与的其它生物学功能
1.3 植物中的糖转运子研究进展
1.3.1 单糖转运子参与的植物糖转运
1.3.2 蔗糖转运子参与的植物糖转运
1.3.3 SWEET转运子参与的植物糖转运
1.3.4 糖转运子的调控
1.4 本研究的目的与意义
2 材料方法
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 载体和菌株
2.2 实验方法
2.2.1 植物材料培养条件
2.2.2 基因家族进化分析及其在叶片中的表达量分析
2.2.3 载体构建及遗传转化
2.2.4 转基因植株阳性检测和拷贝数鉴定
2.2.5 基因表达量检测:RT-PCR,q RT-PCR和 Nothern杂交
2.2.6 可溶性糖和淀粉含量测定
2.2.7 磷酸化蛋白质组分析
2.2.8 转录组分析
2.2.9 酵母双杂交文库构建及筛选
2.2.10 病毒诱导的基因沉默实验(VIGS)
2.2.11 荧光素酶互补成像(LCI)分析
2.2.12 亚细胞定位
2.2.13 双荧光互补(BiFC)实验
2.2.14 蛋白原核表达和Pull-down实验
2.2.15 离子组分析
2.2.16 植物嫁接
2.2.17 基因编辑检测
2.2.18 植物饥饿及葡萄糖胁迫处理
2.2.19 缺素及不同营养水平处理
2.2.20 蒸腾及离体失水分析
2.2.21 水分利用效率分析
3 结果与分析
3.1 陆地棉GhCIPK家族蛋白鉴定及基因表达分析
3.1.1 GhCIPK家族蛋白鉴定和进化树分析
3.1.2 GhCIPK家族在叶片中的表达量及GhCIPK6 表达模式分析
3.2 GhCIPK6 转基因材料分子鉴定
3.2.1 从多拷贝GhCIPK6 超表达棉花中分离单拷贝植株
3.2.2 GhCIPK6 转基因超表达及RNAi棉花分子鉴定
3.2.3 GhCIPK6 敲除突变体阳性检测及突变序列分析
3.2.4 GhCIPK6 转基因超表达拟南芥阳性检测及表达量分析
3.3 GhCIPK6 负调控植物生长发育
3.3.1 GhCIPK6 转基因棉花表型分析
3.3.2 GhCIPK6 转基因拟南芥表型分析
3.4 GhCIPK6 正调控植物可溶性糖积累
3.4.1 GhCIPK6 转基因棉花成株期叶片糖含量分析
3.4.2 GhCIPK6 转基因棉花不同组织可溶性糖含量分析
3.4.3 GhCIPK6 促进棉花糖分积累随着植物的发育进程而增加
3.4.4 GhCIPK6 促进棉花糖分积累依赖GhCIPK6 的表达量
3.4.5 GhCIPK6 在促进棉花糖分积累中与同源基因存在功能冗余
3.4.6 GhCIPK6 调控糖分积累在不同物种中具有保守性
3.4.7 GhCIPK6 不影响糖酵解路径基因的表达
3.4.8 GhCIPK6 削弱了可溶性糖的长距离运输
3.5 GhCIPK6 正调控植株对饥饿及高浓度葡萄糖的耐性
3.6 酵母双杂交筛选GhCIPK6 互作靶标蛋白
3.6.1 酵母双杂交文库的构建及GhCIPK6 互作蛋白筛选
3.6.2 酵母双杂交候选互作蛋白VIGS功能验证
3.6.3 GhCBL家族分析及GhCIPK6-GhCBL点对点酵母双杂交筛选
3.6.4 VIGS对候选GhCBL进行功能验证
3.7 GhCBL2 参与了GhCIPK6 介导的可溶性糖积累
3.7.1 GhCBL2与GhCIPK6 体外互作
3.7.2 GhCBL2与GhCIPK6 体内互作并招募GhCIPK6 到液泡膜
3.7.3 GhCBL2超表达棉花阳性检测及表达量分析
3.7.4 GhCBL2敲除突变体序列分析
3.7.5 GhCBL2正调控棉花可溶性糖积累
3.7.6 GhCBL2 突变削弱了GhCIPK6 介导的葡萄糖积累
3.8 磷酸化蛋白质组学筛选GhCIPK6 潜在下游靶标
3.8.1 差异磷酸化蛋白分析
3.8.2 磷酸化候选蛋白VIGS功能验证
3.9 Gh TST2 参与了GhCIPK6 介导的可溶性糖积累
3.9.1 GhTST家族分析
3.9.2 Gh TST2与GhCIPK6 酵母双杂交及Pull-down分析
3.9.3 Gh TST2与GhCIPK6 Bi FC体内互作实验
3.9.4 棉花GhTST2超表达植株阳性检测及表达量分析
3.9.5 棉花GhTST2敲除突变体突变序列分析及表达量检测
3.9.6 拟南芥AtTST1/2敲除突变体创建及突变序列分析
3.9.7 GhTST2正调控棉花可溶性糖含量
3.9.8 Gh TST2 突变削弱了GhCIPK6 介导的棉花可溶性糖积累
3.9.9 At TST1/2 突变阻断了GhCIPK6 在拟南芥中介导的可溶性糖积累
3.10 GhCIPK6 的其他生物学功能
3.10.1 GhCIPK6 负调控植株矿质营养的含量
3.10.2 超表达GhCIPK6 加速离体条件下叶片失水速率
3.10.3 超表达GhCIPK6 降低植株蒸腾作用并提高水分利用效率
3.10.4 矿质元素与植物可溶性糖含量及蒸腾的关系
3.10.5 GhCIPK6 参与对糖含量和水分利用的调控是独立的
3.10.6 GhCIPK6 转基因材料转录组分析
4 讨论
4.1 GhCIPK6 参与调节植物糖稳态
4.2 GhCIPK6 调控糖稳态的路径存在功能冗余
4.3 糖在植物生长发育和逆境抗性中的作用
4.4 CIPK6功能多样性
参考文献
附录
攻读学位期间已发表和待发表的论文
致谢
本文编号：4020106
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