【摘要】：海参养殖是海洋经济中的一大产业,海参养殖环境中耐药菌的分布是人们比较关心的问题。抗生素进入海水养殖环境筛选出耐药细菌,增加环境中耐药基因的水平转移和重组,造成耐药基因在环境、动物和人体细菌抗性染色体中的流通,从而导致耐药基因转移至人体致病菌的抗性染色体中,危害人类健康。因此耐药菌的分布分析有着非常重要的意义。本实验以在荣成两处海参养殖池(122°14′34″E 36°54′36″N)和双岛湾(121°57′52″E 37°28′16″N)中采集的五组样品(SS1、WS1、SS2、WS2、WS3)为实验对象,利用稀释涂布法估算SSl、WS1、SS2、WS2、WS3每克或者每毫升样品中可培养细菌的数量,分别约为54.4x104、3.6x104、40×104、20.5×104、4.2×104,通过不同的抗生素筛选培养基培养发现,所有样品中,四环素和克林霉素耐性菌的比例都相对较高。药敏纸片扩散法测定分离菌株的表型耐药性,计算MAR指数,比较分析五组样品间耐药菌分布的异同。我们发现沉积物样品中耐药菌的分布显著大于水样品中耐药菌的分布；分离菌株对氨基糖苷类、四环素类、林可酰胺类抗生素的耐药频率显著高于分离菌株对β-内酰胺类、利福平、氯霉素类、大环内酯类、喹诺酮类抗生素的耐药频率；耐药菌在海参养殖环境和远离人类活动的非养殖环境中都有分布；在分离到的多重耐药菌中,变形菌门细菌占43.28%,厚壁菌门细菌占28.36%,拟杆菌门细菌占25.37%,放线菌门细菌占2.99%。基于16S rDNA序列,分析了105株分离菌株的分类地位并将其保藏入-80°C超低温冰箱,其中变型菌门细菌53株,厚壁菌门细菌26株,拟杆菌门细菌24株,放线菌门细菌2株,其中相似度小于98%的潜在新细菌32株。除了分析海参养殖环境耐药菌的分布之外,本实验还从不同的样品中分离到五株海洋新细菌,利用多相分类的手段鉴定其分类地位。从北极某海域(8°21′629″E 72°8′827″N)沉积物中分离到一株海洋新细菌,编号为435。过氧化氢酶和氧化酶都是阳性,菌落呈现似大米透明色,兼性厌氧,革兰氏阴性。菌株435T的细胞形态为短杆或弯曲杆状,耐受温度范围是4-25℃、pH 6.0-9.0、耐受盐度范围是0.5-6.0%(w/v)NaCl.呼吸醌为Q-8,主要极性脂是磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油,主要脂肪酸是15:1ω8c sum in feature 3 (comprising C16.1ω7c/15 iso2-OH)、 C17:1ω8c、 C15:0。 16S rDNA序列系统发育分析显示,菌株435T与科尔韦尔氏菌属相似度在92.1%-95.6%之间,基因组DNAG+C含量是38.7 mo1%。综合不同的表型特征以及系统发育学和遗传学分析,建议菌株435T (= CICC 10860T= ATCC BAA-2609T)代表科尔韦尔氏菌属的一个新物种,命名为北极科尔韦尔氏菌(Colwellia arctica sp. nov.) 。菌株SY21T是分离自威海近海海岸带(122°0′37″E 37°31′33″N)沉积物的一株海洋新细菌。最适生长温度在33-37°C之间,最适生长pH为pH 7.0-7.5,最适盐度2-3%(w/v)NaCl.呼吸醌类型是MK-7,主要脂肪酸包括iso-C15:0、iso-C17:03-OH和anteiso-C15:0'主要极性脂是磷脂酰乙醇胺、氨脂质和一个未知成分的脂质,基因组DNA G+C含量是37.9 mo1%。根据16S rDNA序列系统发育分析显示,菌株SY21T与厌氧海洋吞噬菌JCM 18693T的相似度最高(94.7%)。依据与其他菌株系统发育关系和不同的表型特征,菌株SY21T可以和其他菌株区分开。实验数据可以说明菌株SY21T是海洋吞噬菌属的一个新物种,建议命名为沉积物海洋吞噬菌(Mariniphaga sediminis sp. nov.),模式菌株是SY21T (=KCTC 42260T= MCCC 1H00107T) 。菌株FB218T是通过富集分离的方法得到的来自于山东威海荣成某海参养殖池的底泥(122°14′25.9″E 36°57′26.2″N)的细菌。菌落呈黄色,革兰氏阴性、兼性厌氧。16S rRNA基因序列系统发育分析显示菌株FB218T应该归属于海洋滑动菌科,和嗜中温羧酸利用杆菌JCM 18290T和大安县羧酸利用杆菌JCM 19490T亲缘关系最相近。菌株FB218T的主要脂肪酸包括iso-C15:0、 iso-C17:03-OH、 iso-C15:03-OH和anteiso-C15:0'主要极性脂是两个未知成分的脂质和磷脂,呼吸醌是MK-7。基因组DNA G+C含量是40.0 mol%。实验数据证明菌株FB218T代表了羧酸利用杆菌属的一株新物种,建议命名为细线形羧酸利用杆菌。模式菌株是FB218T(Carboxylicivirga linearis sp. nov.),模式菌株为FB218T (=KCTC 42260T= MCCC 1H00107T).菌株MF326T来源于威海荣成某海参池沉积物(122°14′34″E 36°54′36″N),菌落为黄色,革兰氏阴性、兼性厌氧。基于16S rRNA基因的系统发育分析,菌株MF326T与牡蛎海研站菌和藻海研站菌相似度最高,分别是94.3%和93.9%,可以说明菌株MF326T应该是海研站菌属的一株新物种。菌株MF326T的主要脂肪酸是iSO-C15:0,、链长为13.565的未知脂肪酸和anteiso-C15.0主要极性脂是两个未知成分的脂质和磷脂酰乙醇胺。呼吸醌类型是MK-6,基因组DNA G+C含量是40.7mol%。综合分析,菌株MF326T是海研站菌属的一株新细菌,建议命名沉积物海研站菌(Mesonia sediminis sp. nov.),模式菌株MF326T (=KCTC 42255T= MCCC1H00125T)菌株HQYD1T分离于柄海鞘,是一株革兰氏阴性、兼性厌氧、菌落呈橙色的海洋细菌。菌株HQYD1T的细胞杆状且能通过滑动的方式运动。最适生长温度是28℃,最适生长盐度是2-3%NaCL菌株HQYD1T的16SrRNA基因序列与菌株Y11T的相似度最高(94.83%),其次是与发酵糖丝菌DSM 9555T(92.28%)菌株HQYD1T检测到的主要脂肪酸是C16：0、C18：0和iso-C15:0'主要极性脂是两个未知成分的脂质和磷脂,主要呼吸醌类型是MK-7。综合实验数据,建议建立滑动杆菌属为海洋滑动菌科的一个新属,建议菌株HQYD1T为滑动杆菌属的一个新物种,新属命名为滑动杆菌属(Labilibacter gen. nov.),新种命名为橙色滑动杆菌(Labilibacter aurantiaca gen. nov. sp. nov.),模式菌株HQYD1T (=MCCC 1K02304T= KCTC42583T).另外,建议将原海洋糖丝菌Y11T修订,划分到滑动杆菌属,命名为海洋滑动杆菌(Labilibacter marina comb. nov.),模式菌株是Y11T (=CICC10837T= KCTC42400T)本实验分析了海参养殖环境中耐药细菌的分布,可以为有关部门的监管和治理提供理论基础；鉴定了五株海洋新细菌,丰富了海洋微生物资源库,同时也为一些潜在新基因的研究储备了资源。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.1
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本文编号：
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