【摘要】：益生菌具有促进水产动物生长及免疫力等优点被广泛应用于水产动物养殖。虾酱是由虾体及虾体内外微生物发酵而成,其中存在乳酸杆菌(Lactobacillus)、酵母菌(yeast)和芽孢杆菌(bacillus)等多种益生菌。目前,尚未见从虾酱中筛选出益生菌应用于斑节对虾养殖的报道。本研究以传统发酵工艺制作的虾酱为材料,通过平板划线分离法,从中分离具有强产酶能力和强拮抗能力的潜在益生菌,然后通过拌料投喂,研究筛选的益生菌对斑节对虾的生长、消化酶活性、非特异免疫力以及对水质的影响。(1)本研究以传统发酵工艺制作的虾酱为材料,通过分离纯化、溶血活性、产酶活性和拮抗活性检测从虾酱中分离微生物,结果如下:从海南省定安城生产的帮辉海虾调味酱虾酱和海口市本地产的虾酱中,利用BCP培养基,从两种虾酱中共分离到产酸的菌株306株。通过溶血活性测定发现,在306株产酸菌株中有36株为Y溶血,占总数的11.8%。测定上述36株菌的产酶活性,包括蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活性,并测定其拮抗能力,病原菌为海水水产致病菌包括哈维氏弧菌(Vibrio Harveyi)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)及溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和淡水水产致病菌包括嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)及无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)。结果发现,选出的36株γ溶血的待选益生菌的淀粉酶和蛋白酶的活性比较高,其中A27、A35、B47为高产酶菌株,产蛋白酶和淀粉酶的活性与其他菌株具有显著差异(P0.05) ; A20酶活和拮抗能力强,其产淀粉酶的活性与其他菌株具有显著差异(P0.05)且对4种致病菌的拮抗能力显著高于其它菌株(P0.05) ; B3是强拮抗能力菌株,对实验所选的5种致病菌均有拮抗能力,且对其中的4种致病菌的拮抗能力显著高于其它菌株(P0.05) ; A11、B15和B89具有酶活和拮抗能力,至少对1种致病菌的拮抗能力显著高于其它菌株(P0.05)。通过16SrRNA分子鉴定此8株菌均为芽孢杆菌属。(2)通过耐酸、耐胆盐、耐人工胃肠液和粘附能力及药敏实验对上述分离获得8株芽孢杆菌进行检测,结果发现:芽孢杆菌A11、A20、A27、B47和B89的耐受能力强,A20和A27在强酸作用60 min和120 min的迟滞时间(LT)都具有显著性差异(P0.05);在胆盐浓度为0.1%、0.3%和0.5%时,A20的LT都具有显著性差异(P0.05);当人工胃液作用时间为3h时,A20和A27与其他菌株具有显著性差异(P 0.05);当人工肠液作用时间为4 h时,A27与其他菌株具有显著性差异(P 0.05)。而在粘附性实验中,A20和A27各个时间段的自凝率都高,24h的自凝集率达到了 98%及以上,显著高于其他菌株(P0.05),A20和A27对所选的5种水产致病菌的共凝集率均有显著差异(P0.05),且共凝集率达70%以上;在抗生素的耐药性实验中,A20和A27的敏感率是最高的。(3)将筛选出的芽孢杆菌A20和A27按照2.5 × 108CFU/g饲料的浓度拌料投喂斑节对虾,检测两株芽孢杆菌对斑节对虾生长、非特异免疫力和消化酶活性的影响,结果显示饲养斑节对虾6周后实验组A20和A27组优于对照组,各项指标如下:①斑节对虾养殖实验的第2至6周,水体中化学需氧量(COD)、氨氮和亚硝酸盐的浓度,投喂芽孢杆菌的A20组和A27组都显著低于对照组(P0.05),且A27组与对照组有极显著差异(P 0.01)。总体来说水体中有害物质的含量,实验组比对照组少,且A27组净化水质的作用最明显;②生长性能的测定中,实验组A20组和A27组的体长、体重、肥满度、增重率和特定生长率都高于对照组,其中A20组的体重极显著高于对照组(P 0.01)且增重率和特定生长率显著差高于对照组(P 0.05),A20组的生长性能高于A27组;③非特异免疫指标中,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(POD),添加芽孢杆菌的A20组和A27组都显著高于对照组(P 0.05),A20组和A27组的酸性磷酸酶(ACP)都极显著高于对照组(P0.01),A20组的溶菌酶(LSZ)显著高于对照组(P0.05),且A20组的非特异性指标高于A27组;④消化酶活性的测定中,添加芽孢杆菌的A20组和A27组的胰蛋白酶及淀粉酶均极显著高于对照组(P 0.01)。从虾酱筛选出的γ溶血菌株,且产酸、酶活和拮抗能力强,及具有耐受性、粘附性和对抗生素敏感的芽孢杆菌A20和A27,在一定程度上提高了实验斑节对虾的消化酶活性和非特异免疫力,促进斑节对虾生长,并具有改善水质的作用,芽孢杆菌A20在促进斑节对虾的生长、非特异免疫力和消化酶活性方面较好;芽孢杆菌A27在改善水质方面更具有优势。
【图文】：
．图２－１八株潜在益生菌的系统进化树逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｔｈｅ邋ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ｔｒｅｅ邋ｏｆ邋ｅｉｇｈｔ邋ｐｏｔｅｎｔｉａｌ邋ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ逡逑１８逡逑
逦Ｂ１５逦Ｂ４７逦Ｂ８９逡逑菌株逡逑图３－２八株芽孢杆菌在人工肠液的存活率，ａｂｅｄ表示每个时间段中存活率的显著性水平逡逑（／＞＜０．０５）逡逑Ｆｉｇ．邋３－２邋Ｔｈｅ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｃｕｒｖｅ邋ｆｏｒ邋ｅｉｇｈｔ邋Ｂａｃｉｌｌｕｓ邋ｓｐｐ．邋ｉｎ邋ｓｉｍｕｌａｔｅｄ邋ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ邋ｆｌｕｉｄ，，邋ａｂｅｄ邋ｉｓ逡逑ｉｎｄｉｃａｔｅｄ邋ｔｈｅ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ｌｅｖｅｌ邋ｏｆ邋ｓｕｒｖｉｖａｌ邋ｒａｔｅ邋ｉｎ邋ｅａｃｈ邋ｔｉｍｅ邋ｐｅｒｉｏｄ邋（Ｐ＜邋０．０５）．逡逑３．邋３．邋３粘附性的测定逡逑（１）自凝集逡逑自凝集率见图３－３，由图可知Ａ２０和Ａ２７各个时间段的自凝集效果都比较好，逡逑２４邋ｈ的自凝集率达到了邋９８％及以上；Ａｌｌ在前４邋ｈ内的自凝集率的增长率最快，逡逑２４ｈ达到了邋９０％；邋Ａ３５、Ｂ３、Ｂ１５和Ｂ８９的自凝集率在２、４和２４ｈ时都一般，逡逑最后达到７０％左右
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S968.22
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本文编号：2612495
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