肠道菌群与鱼类病毒感染互作模型研究

发布时间：2020-04-05 00:58

【摘要】：我国水产养殖业体量巨大,给人们提供了大量的优质蛋白,是我国养殖业的支柱产业之一。病毒病是危害水产养殖业的主要传染性疾病,传统的治疗手段无法有效的杀灭鱼体的病毒和控制其传播。肠道菌群如今已被证实参与机体和病毒互作,调控机体抗病毒免疫,与此相应的,部分研究表明益生菌可有效控制水生病毒对养殖鱼类的感染和传播。我们首先分析了同一发病鱼塘中感染和不感染鲤鱼疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)的鲤鱼(Cyprinus carpio)的肠道菌群,发现发病鲤鱼肠道肠杆菌和假单胞菌的丰度与正常鲤鱼有着明显差异,但整体的菌群结构未见显著性区别。之后我们分析了对CyHV-2有不同抗性的两种异育银鲫(Carassius auratus gibelio)的肠道菌群,发现两种异育银鲫品系的肠道菌群结构高度相似,二者只是在个别低丰度的属种出现显著性的差异。为了进一步在实验室可控的条件下研究肠道菌群对鱼类病毒感染的可能影响,我们在实验室条件下,成功模拟了鲤鱼春季病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus,SVCV)的自然传播途径,建立了基于成年斑马鱼的病毒感染模型。通过给3月龄正常成年斑马鱼腹腔注射10~8 copies的SVCV,在其发病后与正常1月龄斑马鱼共浴,使1月龄斑马鱼感染SVCV。并且检测了共浴鱼中高带毒鱼体和不带毒(或带毒量极低)鱼体肠道菌群及抗病毒相关基因的表达。结果显示不带毒鱼体中抗病毒免疫相关基因Rig-I、MxB、pkz、IFN phi1、IFN phi2的表达量均显著高于高带毒鱼体,说明不带毒鱼体的天然抗病毒免疫反应高于高带毒鱼。然而,不带毒鱼体和高带毒鱼体的肠道细菌数量和主要门和属的丰度无显著性差异。最后,我们采用了无菌斑马鱼生产技术,建立了无菌斑马鱼病毒浸浴感染模型。使用约10~8copies/mL SVCV浸浴感染无菌斑马鱼。浸浴攻毒后斑马鱼在第3日出现死亡,7日内为死亡高峰期,最大死亡率在40-70%之间。我们使用该模型初步探究了斑马鱼肠道菌群和几株代表性的肠道菌株对病毒感染的影响。结果显示该感染模型稳定可靠,在24 h菌鱼互作周期下未观察到肠道菌群和代表菌株对病毒感染的影响。72 h周期下观察到鲸杆菌(Cetobacterium)和类志贺邻单胞菌(Plesimonas shigelloides)显著地降低了斑马鱼幼鱼在浸浴病毒后的死亡率。本研究表明在野外条件下染毒程度不同的鲤鱼和不同异育银鲫品系健康状态下肠道菌群未呈现显著差异,进一步我们在实验条件下构建了共浴感染模型和无菌斑马鱼感染模型,为下一步研究菌群对鱼类宿主病毒感染的影响以及快速筛选益生菌株(抗病毒感染)提供了支撑。
【图文】：

序列,流行病学特征,病鱼,正常鱼

13A：病鱼鳃；B：正常鱼鳃；C：病鱼头部；D：正常鱼头部；E：病鱼内脏；F：正常鱼内脏图 2.1 病鱼流行病学特征Fig 2.1 Epidemiological characteristics of diseased fish2.4.2 病毒测序鉴定使用 CyHV-2 的 DNA 聚合酶基因引物来扩增病鱼肾脏组织提取的 DNA 后，产物大小为362bp，扩增产物测序后与 NCBI 中 CyHV-2 序列进行比对，结果如图 2.2。与 CyHV-2 的日本分离株相比，本次提取的病毒 DNA 扩增出的 DNA 聚合酶基因序列有两个碱基的突变，可以认为是

引物,病鱼,丰度,鲤鱼

中国农业科学院硕士学位论文第二章养殖鱼塘感染病毒的鲤鱼肠道菌群分析同一种病毒。2.4.3 PCoA 主坐标分析结果使用 PCoaA 主坐标分析的方法，得到三种鲤鱼菌群差异的 PCOA 图，，如图 2.3。图中三种样本点越接近，表明两样本物种组成越相似。图上三种的鲤鱼肠道样本分散程度较大且无明显差异。说明肠道菌群组成无显著差异。2.4.4 LEfSe 分析对三种鱼进行 LEfSe 分析，结果如图 2.4。统计发病鱼塘的未发病鱼和发病后存活鱼两个组别当中有显著作用的微生物类群通过 LDA 分析（线性回归分析）后获得的 LDA 分值，如图 2.5。结果显示，发病鱼塘的未发病鱼和发病后存活鱼在肠杆菌科（Enterobacteriaceae）丰度上有显著差异，发病鱼体内其丰度均为 2.99%，未发病鱼则均为 1.99%。两者在假单胞菌属（Pseudomonas）丰度上有显著差异，发病鱼体内丰度均为 0.29%，未发病鱼则均为 1.73%。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S941.41

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