华南海水鱼类网箱养殖区耐药菌和耐药基因研究

发布时间：2020-04-08 18:22

【摘要】：近十年来,随着世界各地耐药现象的频频发生,细菌耐药已经引起了世界各国人民的广泛关注,也成为了当前最热门的科学研究之一。海水网箱养殖作为我国水产养殖业重要的养殖方式之一,为人们提供美味、营养的海产品的同时,也为我国经济发展做出了重要的贡献。华南沿海地区是我国海水鱼养殖的密集之地,其养殖规模大、历史悠久、品种繁多,且病害情况复杂、发病率高、死亡率高。由于当前缺乏对兽用抗生素的有效监管和使用指导,使得水产养殖活动上的抗生素滥用、误用现象严重。这不仅会导致海水环境的日趋恶化以及水产品中药物残留严重,更为严重的是致使耐药性病原菌(Antibiotic-resistant bacteria,ARB)的出现。细菌的耐药性可以通过耐药基因(Antibiotic resistance genes,ARGs)进行水平传播和垂直传播,对环境安全、食品安全及人类健康都造成了巨大的威胁。本研究分别在苗期(4月份)、饲养期(7月份)、捕捞期(10月份)对海南省六个主要海水网箱养殖区文昌市会文镇(HW)、万宁市和乐镇(HL)、陵水(LS)、三亚市铁炉港(TLG)、儋州市海头港(HTG)、临高县(LG)和广东省七个主要海水网箱养殖区潮州市饶平(RP)、惠州市盐洲岛(YZD)、深圳市大亚湾(DYW)、珠海市桂山岛(GSD)、阳江市海陵岛(YJ)、湛江市南三岛(ZJ)、揭阳市流沙镇(LS)的ARB和ARGs分布进行了采样调查。分别采用药物平板筛选法和荧光定量技术对海水养殖环境中ARB和ARGs的丰度及多样性进行表征。揭示了各海水养殖区和不同养殖时期ARB和ARGs的丰度分布情况,掌握了ARB和ARGs丰度随时空变化的规律。通过结合环境因子、ARB、ARGs进行冗余分析(RDA analysis),探明了环境因子、ARB和ARGs之间的相关性。在此调查基础上,通过对V.harveyi 345进行体外诱导,成功获得了哈维弧菌对环丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)的耐药株,利用重测序技术对原始菌株及不同抗性水平的诱导株进行比较基因组分析,找到了导致哈维弧菌对喹诺酮类药物耐药可能的变异位点,为探寻哈维弧菌对喹诺酮类耐药机制奠定了理论基础。本研究主要研究结果如下:(1)ARB和ARGs广泛分布于海南省各海水鱼类网箱养殖区。各养殖时期ARB浓度在5.5×10~1~2.6×10~4 CFU/mL之间,苗期阿莫西林(Amoxicillin,AMO)和庆大霉素(Gentamicin,GEN)细菌耐药率最高,在HW海区高达100%;而饲养期和捕捞期土霉素(Oxytetracycline,OT)细菌耐药率较高。不同海区细菌耐药率具有显著性差异(p0.05),总体来看,HW海区细菌耐药率较高,而TLG、HTG和LG海区细菌耐药率普遍偏低。从ARB多样性来看,苗期327株ARB被鉴定为32个属,而交替单胞菌属(Alteromonas)和弧菌属(Vibrio)分别占比32.72%和24.77%,为优势ARB;饲养期和捕捞期共715株ARB被鉴定为24个属,Vibrio(76.64%)为绝对优势ARB;而在门类水平上,各养殖时期都以变形菌门(Proteobacteria)为优势门类。13种ARGs除tetS、ermA和ermB未检出,其余ARGs全部检出。总体来看,sul家族基因丰度要高于tet家族基因丰度,且sul2、sul1、sul3在每个采样位点都被检出。但不同采样时期,其优势ARGs出现了明显的替换现象。从时空变化来看,捕捞期ARGs丰度显著高于饲养期(p0.05);HW和HTG海区ARGs总相对丰度显著高于其它海区(p0.05);RDA分析发现,大部分ARGs、ARB与溶氧量(Dissolved oxygen,DO)、pH呈正相关,与盐度呈负相关,温度对ARGs和ARB贡献较小。(2)广东省各海水鱼类网箱养殖区中ARB数量在0-3.94×10~4 CFU/mL之间,除OT耐药菌数量在10~2-10~4 CFU/mL,其他抗生素ARB数量在0-10~2 CFU/mL之间。从细菌耐药率来看,除OT耐药率外(均约34.15%),其他类型的抗生素的细菌耐药率在每个养殖区都很低(均约1.15%)。总体来看,ARB数量及耐药率随时空变化均无显著性差异(p0.05)。从ARB多样性来看,577株ARB被鉴定为40个属,饲养期多样性指数苗期多样性指数捕捞期多样性指数。Vibrio(50.95%)为三个养殖时期的优势ARB,Proteobacteria为优势门类。13种ARGs中,除tetS、tetA外,其它11种ARGs全部被检出,sul1为sul家族中的优势ARGs,tetB为tet家族中的优势ARGs,ermB为erm家族中的优势ARGs,而总的ARGs丰度则是:sulteterm。随着时空变化,捕捞期的ARGs丰度显著性高于苗期和饲养期(p0.01),且RP海区ARGs丰度显著性高于DYW和LS(p0.01),GSD海区ARGs丰度显著高于DYW(p0.05)。RDA分析发现,温度(WT)与大多数ARGs和ARB呈现正相关,而DO和pH与大多数ARGs呈负相关,仅与sul2和tetM呈正相关;盐度与大多数ARGs呈正相关。总体来看,WT、pH、盐度对ARGs和ARB的丰度变化都有着很大的贡献。(3)通过CIP体外诱导,成功获得4株不同耐药水平的耐药株,分别为345-CIP_(50)、345-CIP_(180)、345-CIP_(20g)、345-CIP_(300),与原始菌株F_0相比,各耐药株对CIP的最小抑菌浓度(Minimal inhibit concentration,MIC)分别提升了64、256、256、128倍。这些耐药株对诺氟沙星(Norfloxacin,NOR)和恩诺沙星(Enrofloxacin,ENR)发生了显著的交叉带药现象(4 MIC),且获得的诱导株对NOR的MIC普遍高于CIP一倍。此外,获得的不同耐药水平的耐药株对氟苯尼考(Florfenicol,FFC)的MIC值分别发生了不同倍数的下降。通过在无抗培养基中传代20代的耐药株345-CIP_(20g)耐药表型发生了轻微回复。通过不同耐药水平的耐药株的生长速率比较发现,菌株的耐药水平与生长速率呈显著性负相关(p0.01)。(4)以原始菌株V.harveyi 345为参考基因组,对345-CIP_(50)、345-CIP_(300)进行重测序,比较基因组分析发现:与耐药相关的变异发生于ATP结合盒家族(ATP-binding cassette,ABC)中的锌吸收系统膜蛋白ZnuB、喹诺酮类耐药决定区GyrA、双组份系统中OmpR家族中的组氨酸蛋白激酶EnvZ、LuxR家族中编码组氨酸激酶TtrS及群体感应系统中的跨膜蛋白YscT,SctT,HrcT,表明这些蛋白对细菌耐药具有重要作用。总体来看,两株不同抗性水平的菌株的SNP变异基本一致,未发现345-CIP_(300)有特殊的与耐药相关的SNP。通过InDel分析发现,外膜孔道蛋白OmpA和OmpF、趋化蛋白CheW及AcrAB-TolC外排系统中的AcrA蛋白基因组上的变异均与耐药相关,推测这些变异可能是导致细菌高水平耐药的主要原因。
【图文】：

传播途径,动物,多样性

图 1-1 ARB 和 ARGs 在人-动物-环境之间的传播途径[8]Fig 1.1 Dissemination of drug-resistant bacteria/drug resistance genes inhuman-animal-environment1.1.2 环境中 ARB 的分布及多样性

分布图,海南省,位点,样品处理

海南省采样位点分布图
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S948;S967.3

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