鲤春病毒血症病毒诱导细胞凋亡与病毒增殖关系初步研究

发布时间：2020-04-09 00:52

【摘要】：鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus,SVCV),是鲤春病毒血症(Spring viremia of carp,SVC)的病原。SVC对鲤科鱼类养殖业危害巨大,且其致病机理尚不明确,国际动物卫生组织(OIE)将SVC定为必须上报的鱼类疾病之一,我国农业部也将SVC定为一类动物疫病。细胞凋亡是细胞应对多种刺激的一种主动、高度有序的细胞程序性死亡过程,对维持机体内外环境稳定具有重要意义。为了解SVCV的致病机理,本研究对SVCV感染细胞后病毒在细胞内的增殖情况及SVCV诱导细胞凋亡机制进行初步探究。首先通过对EPC、CO两种细胞进行病毒感染,对比TCID_(50)测定结果,选择最佳敏感细胞进行后续试验;通过建立SVCV-G蛋白标准曲线,利用qRT-PCR方法对SVCV作用敏感细胞不同时间后病毒增殖检测,探究病毒的增殖与细胞病变存在的关系。结果表明:相对于CO细胞,EPC细胞对SVCV更加敏感;qRT-PCR检测,培养8 h后病毒量明显增加,在64 h处达到峰值,与对感染细胞进行形态发生观察时16-32 h细胞开始出现拉网、脱落等明显病变一致。其次利用Hoechst 33258和透射电镜(TEM)对感染连续培养64 h的细胞进行细胞形态发生观察,初步验证SVCV诱导细胞发生凋亡。通过Annexin V-FITC/PI双染法经流式细胞术对感染不同时间点细胞进行凋亡检测和利用抑制剂对caspase-3、8、9表达量进行检测;利用CytoTox 96非放射性细胞毒性检测法,检测感染SVCV的EPC后培养液中LDH的浓度,间接反映出细胞的存活率。结果表明:Hoechst33258染色发现感染SVCV的EPC细胞出现细胞核结构浓染,发出较强荧光的核碎片等现象,透射电镜可见染色质向边缘凝集,并逐步向胞质脱离,最终形成凋亡小体等一系列细胞凋亡典型表征,证实SVCV可以诱导EPC细胞发生凋亡;通过Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡,感染病毒后32-64h凋亡程度显著增加;caspase-3的表达量随病毒作用时间不断增加,到8 h达到峰值,之后逐渐下降。caspase-8的表达量随时间增加,8 h时表达量达到最高,之后表达量不断降低。caspase-9的表达量变化与caspase-3、8的变化规律大体相同,都存在时间依从性,培养到16 h时caspase-9表达量最高;CytoTox 96非放射性细胞毒性检测培养8 h时,对比未感染组LDH浓度明显增加,培养16 h后,尤其是32 h、64 h,感染组的LDH远远高于对照组。本试验初步探究了SVCV感染后对EPC细胞的影响,验证了该病毒可以诱导EPC细胞发生凋亡,对病毒增殖和细胞凋亡的测定确定了病毒作用细胞的活跃时间段,根据caspase-3、8、9表达量上调这一发现,推断SVCV诱导细胞凋亡存在两种凋亡通路且同时发生。这些试验为SVCV诱导EPC细胞凋亡的机制研究奠定了基础,为进一步对SVCV致病机理的研究提供了方向,为SVC的治疗、用药和防控提供了一定的理论依据。
【图文】：

1.4 SVCV 蛋白组成鲤春病毒基因线性不分段，包括 5 个主要的开放阅读框（ORFs），它们按照弹状病毒典型的排列顺序排列，分别可编码：核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）和依赖性 RNA 聚合酶（L）（见图 1.1）[10]。其中，，核蛋白（N）是病毒粒子核衣壳的重要组成蛋白，在 SVCV 的多种主要蛋白中表达量最高，对病毒的转录与调控有至关重要的作用；磷蛋白（P）实际检测含量较少，在病毒粒子的转录过程中起到积极意义，是核衣壳组成中不可缺少的一种蛋白；基质蛋白（M）参与病毒粒子的组装，可抑制宿主细胞转录的过程，从而改变细胞的骨架；糖蛋白（G）存在糖基化，在病毒的出芽成熟和侵入宿主细胞的过程发挥了重要的作用[16]，同时又有很强的免疫原性，是鲤春病毒重要的抗原；依赖性 RNA 聚合酶（L）可以催化病毒粒子的复制和转录，在 20-25℃时，依赖性 RNA 聚合酶活性达到最大。

表 1-6 TCID50测定结果Tab 1-6 Measurement results of TCID50稀释倍数s dilutionEPC 出现 CPE 孔数The appear CPE holes of EPCCO 出现 CPE The appear CPE ho10-18/8 8/810-28/8 8/810-38/8 4/810-48/8 1/810-55/8 0/810-63/8 0/810-70/8 0/8 小时后 EPC、CO 细胞 CPE 图：A. 正常状态 EPC (200×) B.出现 CPC. 正常状态 CO (200×) D. 出现 CPE 的 CO (200×)24 hours after infection EPC、CO cells: A. Normal state EPC (200×) B. TEPC (200×) C. Normal state CO (200×) D. The appear CPE of CO (200
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S943

【参考文献】

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本文编号：2620058