洪湖碘泡虫抗体的制备及其特异性研究

发布时间：2020-04-09 03:51

【摘要】：本研究对异育银鲫“喉孢子虫病”病原—洪湖碘泡虫(Myxobolus honghuensis Liu et Gu,2012)的免疫原性进行了一系列研究,制备出多克隆抗体和单克隆抗体。旨在为建立准确、高效的洪湖碘泡虫免疫学检测方法提供有效工具以及疫苗的开发提供重要候选抗原信息,从而为“喉孢子虫病”的免疫学防控打下坚实基础。本研究的主要结果如下:1.洪湖碘泡虫多克隆抗体的制备及免疫特性分析本研究利用蔗糖密度梯度离心法分离纯化洪湖碘泡虫,经反复冻融、液氮研磨提取可溶性蛋白,免疫小鼠制备得到多克隆抗体,并采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)、间接免疫荧光试验(IFAT)、免疫印迹分析(Western blotting)对多克隆抗体的免疫特性进行分析。结果显示,间接ELISA法测定多抗血清的效价为1:25600;IFAT荧光定位显示洪湖碘泡虫的抗原主要位于极丝、孢子壳瓣的四周及底部一特定位置;Western blotting印记分析显示该多抗血清与洪湖碘泡虫可溶性蛋白中约10条带发生反应,该可溶性蛋白中具有免疫原性的蛋白分子量大小分别约为180 k Da,130 k Da,78 k Da,75 k Da,62 k Da,52 k Da,42 k Da,36 k Da,34 k Da,28 k Da。该多抗血清与碘泡虫属及单极虫属的一些粘孢子虫种类存在一定程度的交叉反应。2.洪湖碘泡虫壳瓣和极丝单克隆抗体的制备与鉴定本研究利用B淋巴细胞杂交瘤技术最终筛选得到两株有效抗洪湖碘泡虫的单克隆抗体1C7和3B7。结果显示,间接ELISA法测定效价分别为1:124000、1:248000,1C7和3B7的亚型分别为Ig M和Ig G1;IFAT定位抗原:单抗1C7特异识别极丝,单抗3B7特异识别成熟孢子壳瓣,两者均不与虫体其它结构发生反应;Western blotting显示:1C7结合抗原的相对分子质量约为130Kda和180Kda,3B7结合抗原的相对分子质量约为28Kda。通过对两株单抗所结合的蛋白进行MS质谱分析并与蛋白质数据库(Uni Prot)比对的结果显示:1C7对应的蛋白可能为BCLF1蛋白(Bcl-2-associated transcription factor 1),3B7对应的蛋白为ANGI_AOTTR蛋白。
【图文】：

的洪湖碘泡虫（图Ⅱ-1A），虫体经过冻融和破碎处理后（图Ⅱ-1B）得到洪湖碘泡虫可溶性蛋白可作为免疫动物的抗原。图Ⅱ-1 洪湖碘泡虫光镜图.A 纯化后虫体；B 破碎后虫体Fig.Ⅱ-1 Light photomicrograph of M. honghuensis.A. purified spores; B. disrupted spores2. 2 可溶性蛋白制备及 SDS-PAGE 分析分离纯化的洪湖碘泡虫经过反复冻融、液氮研磨后，离心得到洪湖碘泡虫的可溶性蛋白，经考马斯亮蓝法测得可溶性蛋白的浓度为 0.511mg/mL。对所得洪湖碘泡虫可溶性蛋白浓度进行适当稀释后进行 SDS-PAGE 分析（图Ⅱ-2），可溶性蛋白在 SDS-PAGE 电泳中主要分布于 17~180kDa 之间，主要蛋白条带大小分别为 56 kDa，52 kDa，，48 kDa，42 kDa

的洪湖碘泡虫（图Ⅱ-1A），虫体经过冻融和破碎处理后（图Ⅱ-1B）得到洪湖碘泡虫可溶性蛋白可作为免疫动物的抗原。图Ⅱ-1 洪湖碘泡虫光镜图.A 纯化后虫体；B 破碎后虫体Fig.Ⅱ-1 Light photomicrograph of M. honghuensis.A. purified spores; B. disrupted spores2. 2 可溶性蛋白制备及 SDS-PAGE 分析分离纯化的洪湖碘泡虫经过反复冻融、液氮研磨后，离心得到洪湖碘泡虫的可溶性蛋白，经考马斯亮蓝法测得可溶性蛋白的浓度为 0.511mg/mL。对所得洪湖碘泡虫可溶性蛋白浓度进行适当稀释后进行 SDS-PAGE 分析（图Ⅱ-2），可溶性蛋白在 SDS-PAGE 电泳中主要分布于 17~180kDa 之间，主要蛋白条带大小分别为 56 kDa，52 kDa，48 kDa，42 kDa
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S941.5

【参考文献】

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1 章晋勇;圆形碘孢虫抗原性及与宿主相互作用研究[D];中国科学院研究生院（水生生物研究所）;2006年

本文编号：2620256