翻译延伸因子eEF1A1b和42Sp50在罗非鱼配子发生中的功能研究

发布时间：2020-04-09 06:33

【摘要】：真核生物翻译延伸因子1A(Eukaryotic translation elongation factor 1,eEF1A)是真核细胞中分布最广泛且含量最丰富的蛋白质之一。eEF1A在真核生物的蛋白质生物合成中扮演着最核心的角色。在肽链延伸的过程中,eEF1A结合GTP和氨酰tRNA形成eEF1A-GTP-tRNA三元复合物,携带氨酰化的tRNA至核糖体A位。当mRNA上的密码子和tRNA携带的反密码子正确识别后,GTP在核糖体中被水解,eEF1A-GDP复合物也从核糖体中游离出来,参与下一轮的肽链延伸反应。配子发生是一个高度复杂的遗传物质传递过程,期间难以计数的蛋白质需要在性腺中合成。虽然eEF1A已被报道广泛地表达于真核生物各个组织器官中,但其在性腺中的表达及其在配子发生中扮演的角色仍有待阐明。哺乳动物有2个eEF1A基因eEF1A1和eEF1A2,但仅有eEF1A1在雌雄性腺中表达。硬骨鱼类具有5个eEF1A基因,且不同的eEF1A基因在不同组织中的表达。本实验室前期在尼罗罗非鱼中分离出一个在精巢中高表达的eEF1A1b,以及一个卵巢中特异表达的42Sp50。利用已有的42Sp50多克隆抗体和本研究制备的eEF1A1b多克隆抗体,通过Western blot和免疫组化分析了eEF1A1b和42Sp50在尼罗罗非鱼不同发育阶段性腺中的表达模式和细胞定位。通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术成功突变eEF1A1b和42Sp50,并建立了突变系,分析了相应突变体的配子发生的情况、基因表达以及血清雌雄激素的水平。具体研究结果如下:1)eEF1A1b在性腺发育过程中的表达模式和细胞定位。Western blot分析结果表明:在精巢中,eEF1A1b在孵化后90天(day after hatching,dah)开始呈现高表达,在120 dah时表达量达到最高,在300 dah表达量降低;在卵巢中,eEF1A1b的表达量始终很低。免疫组化分析表明,eEF1A1b特异地表达在精巢的精原细胞,以及卵巢的卵原细胞和I时相卵母细胞中。2)eEF1A1b在性腺中的功能研究分析。通过CRISPR/Cas9成功突变罗非鱼eEF1A1b,并获得了杂合突变鱼,分析了F0代突变嵌合体和F1代杂合子雄鱼的性腺表型,发现二者表现出基本相同的表型。eEF1A1b的杂合突变导致精子发生阻滞、类固醇发生降低和精子形变异常,最终引发雄性不育。eEF1A1b~(+/-)雄鱼的性腺成熟指数(GSI)显著小于野生型雄鱼。野生型雄鱼的精巢在90 dah时已可观察到精原细胞、精母细胞和精细胞的存在;在120 dah时含有各级生精细胞和少量的精子;在150和180 dah时已经含有大量成熟的精子。然而,eEF1A1b~(+/-)精巢在90 dah时仅存在精原细胞,在120 dah开始出现少量精母细胞,在150和180 dah时eEF1A1b~(+/-)精巢中虽然具有各级生精细胞,但精母细胞、精子细胞和精子的数量远远少于野生型精巢。同时,eEF1A1b~(+/-)雄鱼的血清雄激素11-KT水平显著低于野生型雄鱼。育性实验表明,eEF1A1b~(+/-)雄鱼的精子不具备受精能力。精子分析实验发现,相对于野生型雄鱼的精子,eEF1A1b~(+/-)雄鱼的精子浓度明显降低,精子畸形率显著上升,绝大多数eEF1A1b~(+/-)雄鱼的精子呈现无尾或尾部缩短,精子运动能力极差,其前向运动能力以及游动速度都显著低于野生型雄鱼的精子。转录组测序分析结合real time PCR验证分析发现,精子发生关键基因(例如:aspm、cdk16、suz12a和usp26)的表达水平在eEF1A1b~(+/-)精巢中显著降低。这些基因与eEF1A1b一样表达在精原细胞中,推测eEF1A1b突变可能导致精原细胞中的蛋白质翻译受阻,继而引起精子发生阻滞。同时,精子鞭毛形成的关键基因(tuba1b、tuba3d和tuba8)表达紊乱,可能是导致eEF1A1b~(+/-)雄鱼精子形变异常的主要原因。此外,类固醇发生相关基因(sf-1、cyp11a1、star和cyp11b2)在eEF1A1b~(+/-)精巢中的表达水平显著降低,导致eEF1A1b~(+/-)雄鱼的血清雄激素降低。然而,类固醇发生相关基因均表达在精巢的Leydig细胞中,而eEF1A1b仅表达于精原细胞,因此eEF1A1b突变对类固醇发生相关基因的影响应该是一种间接影响,推测精原细胞中衍生的信号可能通过直接或间接途径作用于Leydig细胞。过表达eEF1A1b成功回救eEF1A1b~(+/-)精巢精子发生阻滞的表型,表明精巢中产生的表型确实是由于eEF1A1b突变导致的。另一方面,虽然eEF1A1b在卵巢中有少量的表达,但eEF1A1b的突变并不影响雌鱼的卵子发生和育性。3)42Sp50在性腺发育过程中的表达模式和细胞定位。Western blot分析结果表明:在卵巢中,42Sp50在30 dah时表达量较低,在60-90dah时呈现高表达,在180 dah时表达量降低;在精巢中,始终检测不到42Sp50的表达。荧光免疫组化分析表明,42Sp50在60-180 dah的卵巢中均特异地表达在I、II时相的卵母细胞中,而在精巢中始终没有检测到42Sp50的免疫荧光。4)42Sp50在性腺中的功能研究分析。通过CRISPR/Cas9成功突变罗非鱼42Sp50,并构建了纯合突变系,分析了F2代纯合子的表型。研究发现缺失42Sp50导致滤泡形成障碍、卵母细胞滞育和类固醇发生抑制,最终引起雌性不育。在120dah时,42Sp50~(-/-)和野生型卵巢在解剖学和组织学水平未发现明显差异。42Sp50~(-/-)和野生型雌鱼的GSI并无显著差异,且两者卵巢中均含有卵原细胞、I和II时相卵母细胞。卵母细胞计数分析表明,42Sp50~(-/-)与野生型卵巢中I和II时相卵母细胞的数量无显著差异,证明缺失42Sp50并不影响卵巢减数分裂起始和卵母细胞的早期发育。在180 dah时,42Sp50~(-/-)卵巢明显小于野生型卵巢,42Sp50~(-/-)雌鱼的GSI显著低于野生型雌鱼。组织学分析结果表明,野生型卵巢中已经出现III时相(卵母细胞中存在皮质颗粒)和IV时相早期(卵母细胞中出现卵黄颗粒)卵母细胞,而42Sp50~(-/-)卵巢中仍只存在I和II时相的卵母细胞。DAPI染色结果表明,野生型的卵巢可检测到在由柱状颗粒细胞和梭型鞘膜细胞形成的成熟的双层滤泡细胞,而在42Sp50~(-/-)卵巢中仅存在由扁平状前体颗粒细胞构成的单层滤泡细胞。Real-time PCR分析结果表明,42Sp50~(-/-)卵巢中卵母细胞生长标记基因bmp15、gdf9、figla和zarI和滤泡细胞标记基因amhr2的表达水平均显著低于野生型卵巢。此外,42Sp50~(-/-)卵巢中类固醇合成酶基因(star2、cyp11a1、cyp17a1、cyp17a2和cyp19a1a)的表达量显著下调,且42Sp50~(-/-)雌鱼的血清雌激素水平同样显著降低。对42Sp50~(-/-)卵巢的转录组测序分析发现,42Sp50~(-/-)卵巢中mTORC1信号通路活性严重受损。已有大量的研究表明mTORC1信号通路对滤泡的形成和卵母细胞发育至关重要。为了验证是否是由于mTORC1信号通路的受损导致42Sp50~(-/-)雌鱼卵泡发生阻滞和类固醇发生障碍,本研究利用mTORC1信号通路抑制剂Rapamycin对野生型雌鱼进行处理并分析卵巢表型。结果显示,Rapamycin处理基本复制了缺失42Sp50在卵巢所导致的表型。Rapamycin处理组雌鱼的卵巢同样表现为滤泡不能正常形成、卵母细胞滞育以及类固醇发生抑制的表型。结合42Sp50的功能缺失实验和Rapamycin处理实验,我们推测mTORC1信号通路活性受损可能是导致42Sp50~(-/-)卵巢滤泡发生障碍和卵母细胞滞育的主要原因之一,42Sp50可能负责mTORC1通路关键蛋白质的合成,亦或是可能对mTORC1信号通路具有直接或间接的调控功能。另一方面,42Sp50并不表达于精巢中,因而缺失42Sp50并不影响雄鱼的精子发生和育性。综上所述,eEF1A1b和42Sp50分别是罗非鱼雄性和雌性生殖细胞特异的eEF1A基因。我们在尼罗罗非鱼中建立了eEF1A1b和42Sp50的突变系,发现eEF1A1b单倍剂量不足导致精子发生阻滞,但不影响雌性卵子发生过程;而42Sp50缺失导致滤泡发生障碍,但不影响精子发生过程,表明在罗非鱼中,翻译延伸因子对配子发生不可或缺,但雌性和雄性的配子发生过程需要不同的eEF1A基因,eEF1A基因在雌性和雄性的配子发生中产生了功能分化。本研究丰富了对eEF1A基因在硬骨鱼类,乃至在脊椎动物配子发生中功能的认知。
【图文】：

示意图,精巢,鱼类,哺乳动物

图 1 哺乳动物和鱼类精巢对比（引自 Hai et al., 2014; Yoshida, 2016）物曲细精管切面示意图。B）鱼类精小叶切面示意图。Sg，精原细胞；Sc，精母细胞ES，长型精子细胞；Sp，精子；SE，支持细胞；PMC/MY，类肌样细胞；BL，基底膜； Comparison of mammalian and fish testis (Cited from Hai et al., 2014; Yosalian spermatogenesis takes place in the germinal epithelium of the seminiferous tubules ofatogenesis takes place in the spermatogenic cyst; Sg, spermatogenesis; Sc, spermatocy ES, elongating spermatids; PMC, peritubular myoid cell; LC, Leydig cells; BL, basal lamin发生发生即是由二倍型的精原细胞经过增殖和分化，，最终形成单倍，该过程高度复杂，却又具有高度的组织性和协调性。精子发中是非常保守的，可以概括分为三个阶段：精原细胞有丝分裂代的精原细胞的产生）、减数分裂阶段（伴随初级精母细胞和次）和精子形成期（伴随单倍型的精子细胞出现，最终形成具有

示意图,卵子发生,鱼类,哺乳动物

物和鱼类卵子发生示意图（引自 Edson et al., 2009; Lubzens eenesis of mammal and fish (Cited from Viran et al., 2009; Lubzeof the major stages of mammalian folliculogenesis. B) Developmental sequen the postvitellogenicphase showing the sequence of chromosomal changes.相关蛋白同样是一个高度复杂的过程，卵母细胞的形成、发育到包括内分泌、自分泌、旁分泌和邻分泌因素的影响的研究指出，卵母细胞的发育过程及其调控主要受垂体 LH 控制（Baird et al., 1981; Danforth, 1995; Hillier, 200技术手段的快速发展和学者们对卵巢研究的深入，已胞和体细胞中合成和分泌的许多蛋白因子对卵巢的发介导和调控促性腺激素活性的功能。这些由卵巢自身个严密的调控网络，在卵母细胞形成、发育与成熟以方面扮演着重要的角色（Ge, 2005; Liu et al., 2006）。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4

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