刺参丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶的克

发布时间：2020-04-11 17:07

【摘要】：刺参作为滋补食品和药膳饮食,深受人们的喜爱。然而,刺参在捕捞、运输和加工过程中极易发生自溶,给相关行业造成重大经济损失。前期研究表明,刺参内源性蛋白酶参与其自溶过程。目前为止,国内外对于刺参自溶酶的基因信息及结构特征研究甚少。基于为国内外学者在该领域的探索提供理论基础,本论文以刺参为研究对象,首次从刺参内脏中克隆得到丝氨酸蛋白酶(serine proteinase,SP)和基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)的基因序列,并利用基因工程技术实现SP和MMP-2的体外表达,获得有活性的重组蛋白酶,同时对其进行性质分析。根据已获得的刺参内脏SP部分氨基酸序列设计特异性引物,利用RT-PCR和RACE技术获得其基因全长共1367 bp,包括44 bp 5’端非编码区和192 bp 3’端非编码区。其ORF为1131 bp,编码377个氨基酸残基,其中Asp138、His176和Ser325构成SP的催化三联体。刺参SP属于Subtilisin家族丝氨酸蛋白酶,其三级结构中含有6个平行的β折叠片,被两侧的α螺旋包围,形成典型的“三明治”结构,此外,在SP的C端还有2个β折叠型结构域参与蛋白质的正确折叠等过程。进一步利用大肠杆菌表达系统体外表达重组刺参SP,通过His Trap亲和柱层析得到大量高度纯化的重组刺参SP。利用重组刺参SP制备特异性多克隆抗体,进一步将具有良好效价和特异性的兔抗重组刺参SP特异性多克隆抗体与CNBr-activated Sepharose 4B亲和柱偶联,制备亲和层析柱纯化得到一部分纯度较高的天然SP。同时通过构建重组质粒p PIC9K-SP并转入毕赤酵母中,利用甲醇诱导表达,获得分子量为70 k Da的有活性的重组刺参SP。根据MMPs保守序列设计引物,首次扩增得到刺参MMP-2酶原的基因序列。刺参MMP-2酶原包括前肽结构域、催化结构域以及类血红素结构域。催化结构域中包含3个相同的II型纤连蛋白,其和类血红素结构域在空间上都是较独立完整的,类血红素结构域通过铰链区与催化结构域相连接。利用大肠杆菌表达刺参MMP-2催化结构域,并通过His Trap亲和柱层析纯化得到分子量约为40 k Da的目的蛋白。通过稀释复性,重组蛋白能够进行正确折叠,首次获得了大量有活性的重组刺参MMP-2。进一步利用明胶酶谱法对重组刺参MMP-2进行性质研究,结果显示重组刺参MMP-2在35°C~40°C活性最高,在p H 7.5~9.0条件下都具有一定的酶活性,最适p H为8.0。此外,适量的金属离子Ca2+可以显著激活重组刺参MMP-2的酶活性。以上结果表明重组刺参MMP-2是一种弱碱性蛋白酶,属于钙离子依赖型金属蛋白酶,与天然MMP-2相似。
【学位授予单位】：集美大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4

【共引文献】