BMP2基因在斑马鱼心脏发育过程中的功能研究

发布时间：2020-04-11 22:13

【摘要】：心脏发育是一个复杂的过程,它受到一系列信号通路的严格调控。在此过程中,转化生长因子-β(TGF-β)信号通路在心脏发育中扮演着重要角色。BMP2(Bone Morphogenetic Protein 2)是TGF-β超家族中的一员,也是BMPs家族成员中研究得较为广泛的一个基因,在胚胎早期发育过程中有重要的调控作用。本研究以斑马鱼为模式动物,研究BMP2基因在斑马鱼心脏发育过程中的作用。生物信息学分析结果表明,BMP2蛋白在不同物种间的进化是保守的。我们首先分析了BMP2在斑马鱼中的时空表达模式,半定量PCR结果显示,BMP2在斑马鱼早期发育不同阶段及成年斑马鱼不同的组织器官中均有表达,主要在胚胎发育的4h-12h表达较高,在脑、心脏、肝脏、鳃、鳍和生殖器官中也有表达。整体胚胎原位杂交实验也确定了斑马鱼BMP2基因在胚胎发育的表达模式。通过morpholinos反义核苷酸敲减技术研究抑制了BMP2基因的表达后对斑马鱼心脏发育产生的影响。MO下调BMP2基因的表达后,斑马鱼的心脏发育显示不同程度的异常表型,主要表现为:心脏不能正常环化、心包囊肿、微弱的血液循环、血液滞留、心跳减缓,部分畸形严重的在5天内死亡。我们还发现MO下调BMP2基因的表达后,斑马鱼的死亡率和畸形率明显高于对照组。把BMP2 MO和BMP2mRNA共注射进行拯救实验,实验结果显示共注射的斑马鱼死亡率和畸形率都明显下降,表明BMP2基因的mRNA能够拯救morpholino反义寡核苷酸敲低BMP2基因表达所产生的异常。另外,通过对斑马鱼心脏标记基因SMAD4、NKX2.5、CMLC2、MEF2C、TBX5、GATA4和HAND2进行QRT-PCR分析,结果显示MO抑制BMP2基因表达的胚胎中,标记基因SMAD4、NKX2.5、CMLC2、MEF2C、TBX5、GATA4和HAND2的表达均受到不同程度的影响。这些结果表明斑马鱼BMP2基因通过调控心脏发育相关转录因子来影响心脏发育。但BMP2具体是通过什么途径影响斑马鱼的心脏发育,还需要更多的研究去阐明。
【图文】：

载体,图谱,斑马鱼

2.1 实验材料2.1.1 实验动物AB 系斑马鱼。严格按照 zebrafish book 上的方法饲养斑马鱼。实验前一上将雄鱼:雌鱼按 1:2 的比例放入交配缸里面，在第二天早上开灯 15 min 后斑马鱼的卵。收集的受精卵用培养斑马鱼的水清洗两次，再用自己配holtfreter 培养液在 28.5 ℃环境中培养。24 hpf 后用加入含 0.003%PTU 的培养可以抑制黑色素的产生，使胚胎透明，便于观察。2.1.2 菌种大肠杆菌 E.coli DH 5α为本实验室保存。2.1.3 载体pGEM-T easy 载体购自 Promega 公司（图 2-1）。

斑马鱼,蛋白,相似程度,模式生物

BMP2 基因在斑马鱼心脏发育过程中的功能研究3 实验结果与分析3.1 BMP2 的同源性分析用 Clustal Omega 软件分析斑马鱼、人和鼠的 BMP2 的蛋白保守序列，，我们发现斑马鱼 BMP2 编码的蛋白与人及鼠的 BMP2 编码的蛋白同源性非常高，说明 BMP2 是一个高度保守的蛋白质。这个结果也说明利用斑马鱼作为模式生物研究 BMP2 在发育中的功能是完全可行的。三者的序列对比结果见（图 3-1）。图中“:”代表相似程度较高；“.”代表相似程度较低；“*”代表完全匹配。
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4

【参考文献】