MicroRNA与Forkhead家族基因在黄鳝性逆转过程中的调控作用

发布时间：2020-04-12 00:29

【摘要】：MicroRNA(简称miRNA)是一类进化上高度保守的小分子非编码RNA,长度大约为22 nt,结合于靶基因的3’非翻译区(UTR),具有转录后调控基因表达和翻译的功能。miRNA在不同物种中发挥着多种生物学功能,包括机体发育,神经调控,细胞增殖与凋亡,脂肪生成与代谢和造血作用等,本研究的内容主要集中于miRNA及其所涉及的生物学途径在性腺分化和生殖细胞的发育等方面的作用。黄鳝(Monopterus albus)在发育的的过程中,具有由雌到雄的自然转变的现象。为了研究其性逆转的生理机制,本研究利用深度测序的方法鉴定出性腺不同发育阶段(雌性,间性和雄性)黄鳝脑、肝脏和性腺中160个成熟的miRNA,其中黄鳝Let-7家族、miR-10b、miR-143、miR-26a、miR-21、miR-181a和miR-9具有较高的表达量；48个miRNA在黄鳝性腺不同发育阶段具有显著的表达差异(P0.001),其中9个miRNA在两两之间超过8倍以上的表达差异,黄鳝miR-430家族成员均表现出显著的表达差异,预测了黄鳝miR-430的靶基因,通过Ingenuity Pathway Analysis(IPA)分析了黄鳝miR-430靶基因间的相互关系,主要涉及到生殖系统发育等一些生物学过程。为了深入研究miR-430家族在鱼类性逆转过程中的作用,我们选择硬骨鱼类性别决定与分化的研究的模式动物—青溕(Oryzias latipes)作为一个比较研究的对象。检测了青溕成鱼雌雄间miR-430家族的表达量,雌雄间的表达量差异从脑、肝脏到性腺逐渐扩大。再分别利用性激素17β-Estradiol和17β-Trenbolone对受精后5 d(5dpf)的胚胎进行7d的暴露试验,暴露后青溕miR-430b的表达量升高。同时,预测了黄鳝和青溕miR-430家族与靶基因foxl2的调控关系,并用双荧光素酶实验进行了验证。结果显示：黄鳝miR-430b结合于黄鳝foxl2基因的3'UTR区域。而青锵中可能由于过短的foxl2 3'UTR,避免了一些miRNA对其的调控,如miR-430家族。因此我们推测黄鳝miR-430家族可能是通过调控foxl2的和其他性别决定基因的表达从而影响黄鳝的性逆转。Forkhead基因家族进化分析认为,foxl2在许多硬骨鱼类中存在不同的拷贝,分别为foxl2a (foxl2)和foxl2b (foxl3)。因此我们推测黄鳝中存在foxl3拷贝并通过RACE方法克隆得到黄鳝foxl3序列,foxl3基因开放阅读框(ORF)长795bP,编码264个氨基酸残基。其中黄鳝Foxl3氨基酸序列与欧洲黑鲈(Dicentrarchus labrax)相似性最高,为82.9%。用最大似然法(ML)构建了11个鱼类Forkhead家族进化发育树,Forkhead家族3个成员分别聚类为3个分支(Foxl1, Foxl2和Fox13),黄鳝Foxl3氨基酸序列与斑马鱼(Danio rerio)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、青溕和欧洲黑鲈聚类为一支,与欧洲黑鲈亲缘关系最近(bootstrap 89)。采用半定量和荧光定量PCR的方法分析了黄鳝foxl3基因的组织分布特征及在性腺中的表达差异,foxl3基因在黄鳝脾脏、肾脏、脑中表达量较高,血细胞和心脏中表达量较低；在黄鳝性腺发育的过程中foxl3的表达量逐渐增加,精巢中的表达量约为卵巢中的40倍,性腺中表达趋势与转录组数据一致。在本研究中通过双荧光素酶实验首次报道了黄鳝miR-9而不是miR-430a结合于靶基因foxl3 3'UTR区域,推测黄鳝foxl3基因转录后可能受到miR-9的调控,对Foxl3的调控可能是研究黄鳝性逆转的一条新途径。
【图文】：

图１．邋ｍｉＲＮＡ的生成与作用机制逡逑Ｆｉｇ邋１．邋ｍｉＲＮＡ邋ｂｉｏｓｙｉｕｈｅｓｉｓ邋ａｎｄ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍ邋ｏｆ邋ａｃｔｉｏｎ逡逑１．２邋ｍｉＲＮＡ在哺乳动物性腺发育中的作用睾丸的生精、卵巢的生卵与内分泌功能受下丘脑－垂体－性腺（睾丸或巧巢）轴

列（１５．５３％）邋｜＾Ｊｌ及个样本间共有的ｍｉＲＮＡ个数（表３）。大部分的序列长度介于２０逡逑到２３邋ｎｔ之间。２２邋ｎｔ的序列占有最高的百分比（如．６３％），雌性、间性和雄性分别占逡逑２１．６３％、１６．１４％和２２．８６％邋（图６Ａ）。选择Ｒｆａｍ数据库注释所有的小ＲＮＡ序列，逡逑其中１５．２２Ｍ的小ＲＮＡ可映射到Ｒｆａｍ数据库，含有８．８９Ｍ邋Ｇ６．２１％）的ｎｃＲＮＡｓ，逡逑包括邋ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｃＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ邋和邋ｓｎｏＲＮＡ邋（图}）。已知的邋ｍｉＲＮＡ邋有邋ｔ巧邋Ｍ逡逑占２５．８０％，包括７５，４巧条唯一的序列；无法映射到Ｒｆａｍ数据库的小ＲＮＡ为９．３２Ｍ逡逑（３７．９７％）。在己知的ｍｉＲＮＡ序列和未映射到Ｒｆａｍ的序列中，６．８４Ｍ邋（４３．７２％）序逡逑列完全匹配上斑马鱼基因组，，其中包括３６５，６５４邋（９．３０％）唯一的序列（图７）。雌性，逡逑间性和雄性的黄

本文编号：2624040