罗氏沼虾四种不同DnaJ基因克隆及表达分析

发布时间：2020-04-17 10:38

【摘要】：DnaJ蛋白是Hsp40家族的一员,存在于多种生物细胞内,是广泛的胁迫响应因子。最初发现于大肠埃希氏杆菌。DnaJ蛋白是Hsp70的伴侣分子,可以独自或协助Hsp70完成蛋白质折叠、解折叠和调节蛋白复合物解聚等功能,对于逆境条件下蛋白质或蛋白复合体的稳定的维持具有重要作用。罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)隶属节肢动物门(Arthropoda),甲壳动物亚门(Crustacea),十足目(Decapoda),长臂虾科(Palaemonidae),沼虾属(Macrobrachium),原产于印度太平洋地区。是目前我国重要的水产经济虾类。但是近年来,由于受到细菌反复感染,使虾类养殖遭受重大挫折。本实验克隆了罗氏沼虾四种DnaJ蛋白基因DnaJ A1、DnaJ B6、DnaJ C2及DnaJ C5。并对它们的结构进行分析,将其分类。利用荧光定量PCR研究了不同组织,温度胁迫及细菌胁迫下四种不同Dna J基因的表达情况,主要结果如下:(1)分别提取嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)侵染后罗氏沼虾(L-I)及正常罗氏沼虾(L-C)的肝脏总RNA。利用Illumina HiSeq高通量测序,并用测序评估、基因注释等生物信息学方法进行分析。结果,经过测序、转录本拼接得到46800条contigs;37605个非冗余的Unigenes,其平均长度为1073bp,共有19382个Unigenes得到了成功注释。丰富和补充了罗氏沼虾基因组信息。(2)根据转录组测序得到的结果,筛选嗜水气单胞菌侵染前后表达差异较大的基因,最终确定本实验想要研究的基因DnaJ。然后根据这些已知部分片段设计RACE特异性引物,利用GeneRacer~(TM)Kit扩增得到cDNA全长。DnaJ A1、DnaJ B6、DnaJ C2和DnaJ C5的cDNA全长分别为1358,999,2319和995 bp,分别编码397,265,617和259个氨基酸序列,其登录号分别为:KY924479、KY924480、KY924481及KY924482。通过生物信息学软件分析了罗氏沼虾与其它生物DnaJ基因编码氨基酸序列的相似性,并根据比对结果将这四种DnaJ蛋白进行分类。DnaJ A1含有保守的J结构域、C/F结构域、锌指CR结构域以及羧基末端结构域(CTD),是典型的I型DnaJ蛋白;DnaJ B6含有J结构域和C/F结构域而不含有锌指结构域,属于II型DnaJ蛋白;而仅含有保守的J结构域的DnaJ C2和DnaJ C5则属于Ⅲ型DnaJ蛋白。(4)分别取罗氏沼虾心脏,鳃,肌肉,肠道,肝脏,卵巢等六种组织,然后提取总RNA,合成cDNA,用于荧光定量表达分析。qRT-PCR结果表明:罗氏沼虾DnaJ A1、DnaJ B6、DnaJ C2和DnaJ C5基因在六种组织中分别都有表达,并且在卵巢组织中都显著表达(P0.05),在其他组织中则存在一定的差异性。温度胁迫选择了四个梯度:15℃,20℃,25℃,30℃。在这些温度下都分别诱导1 h,接着提取肌肉和肝脏的总RNA,合成cDNA,用于荧光定量表达分析。qRT-PCR结果表明:罗氏沼虾四种不同DnaJ基因在15℃,20℃,25℃,30℃的肝脏和肌肉中都有表达。在肝脏中这四种DnaJ基因都对冷胁迫敏感,在15℃和20℃时都显著表达(P0.05),对于冷胁迫具有一定的应激作用。而在肌肉中则表现出差异性,如DnaJ A1,在15℃时表达量显著降低(P0.05),说明低温胁迫使其表达量下调;DnaJ B6则在15℃,20℃,30℃时都表现出下调,说明低温胁迫与高温胁迫都会使其表达量发生下调;DnaJ C2在四个温度下表达量无明显差异(P0.05);而DnaJ C5在15℃时表达量显著(P0.05)。这可能与它们的结构差异有关。为了解四种DnaJ基因在细菌防御中的作用,用嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)进行了细菌侵染实验。分别取嗜水气单胞菌侵染0,1,3,6,9,16,24 h后的肝脏组织,然后提取总RNA,并逆转录为cDNA,用于荧光定量表达分析。荧光结果显示在细菌胁迫后,罗氏沼虾四种DnaJ基因的表达量都发生了显著的上调(P0.05),这表明这四种DnaJ基因可能都参与了罗氏沼虾的细菌免疫应答。但是它们也存在一定的差异性,比如DnaJ A1和DnaJ C2都是在1 h时显著表达(P0.05),达到最大值;而DnaJ B6和DnaJ C5则是在3 h和6 h时显著表达(P0.05),并在6 h时到达峰值;并且就表达量来说,DnaJ A1和DnaJ C2在嗜水气单胞菌侵染后表达量显著高于DnaJ B6和DnaJ C5,而DnaJ B6的表达量整体保持在一个较低的水平。这可能与它们的结构有关,结构差异可能是它们表达量差异的主要原因。总之,本次罗氏沼虾的转录组测序,帮助我们丰富和补充了罗氏沼虾基因组信息,具有一定的参考价值。克隆了罗氏沼虾四种不同DnaJ基因的cDNA全长,并对其不同组织,温度胁迫及细菌胁迫情况下的表达量进行分析。不过目前所做的实验还不够深入,希望之后可以对DnaJ基因的功能做深入研究,并且本实验只用了嗜水气单胞菌作为侵染细菌,之后可以加入其他细菌作为研究。
【图文】：

结构域,蛋白,锌指,斑马鱼

（1）J 结构域：一般由 70 多个氨基酸组成，然后通过 4 个 α-螺旋组形成空间结构，该空间结构上的 α-螺旋能够与 Hsp70 上的 ATPase 联合作用[28,29]。并且该空间结构上存在由脯氨酸、组氨酸和天冬氨酸构成的高度保守 HPD 模块[30-34]，学者证实 DnaJ 蛋白和 Hsp70 的相互作用必须依靠于此模块[35]。（2）（G/F）结构域：在此结构域上有大量的苯丙氨酸以及甘氨酸。此结构域的主要作用就是维持 DnaJ 蛋白和 Hsp70 能够正常的作用[36-39]，但是研究指出如果（G/F）结构域上发生了氨基酸的缺失也不会有什么影响[40]。（3）锌指（CR）结构域：该结构和蛋白质，DNA 以及 RNA 都能发生相互作用，主要原因是其结构域上有 4 个重复序列[41,42]，因此锌指（CR）结构域使得 DnaJ 蛋白不同的功能。例如有学者指出斑马鱼 zf-Hsp40 蛋白有助于的斑马鱼的损伤修复[43]。（4）羧基末端结构域（CTD）：相较于其他 3 个结构域，此结构域最为不保守。它的主要功能是使 DnaJ 蛋白与相对应的底物拥有更强的结合能力，并保证了作用的特异性[44-46]。该结构域通常以二聚体，或者四聚体的形式使 DnaJ 蛋白和 Hsp70 发生作用。

蛋白,类型,底物结合,底物

图 1.2 DnaJ 蛋白的分类Fig.1.2 Types of DnaJ proteinsA：I 类型 DnaJ 蛋白；B：II 类型 DnaJ 蛋白；C：III 类型 DnaJ 蛋白。.3 DnaJ 蛋白的作用原理DnaJ 蛋白和 Hsp70 的相互作用主要是通过作用于 Hsp70 上的 ATPase，使得Pase 的活性大大增加。因为 ATPase 能够与 ADP 和 ATP 结合，但是与 ATP 结的 Hsp70 与所对应底物结合的能力较差，，而与 ADP 结合的 Hsp70 与所对应的物结合的能力却较强[49]，而 DnaJ 蛋白正是通过增大 ATPase 的活性，使 Hsp70多的转变为与 ADP 结合的形态[50]，从而达到让 Hsp70 与所对应底物结合结合力增强的效果，并且该作用机制增强了结合的特异性。不同的 DnaJ 蛋白所用的方式也不尽相同，例如某些 DnaJ 蛋白先直接作用底物，再激活Hsp70上的ATPase[51-53]。也有一些DnaJ蛋白并不能作用于底物，通过高度聚集的 DnaJ 蛋白在固定位置，来提高该位置的 Hsp70 的浓度，从而快 Hsp70 与底物的结合[54,55]；除以上两张作用方式以外另一种 DnaJ 蛋白和
【学位授予单位】：中国计量大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4;Q78

【参考文献】