军曹鱼类胰岛素生长因子-I的克

发布时间：2020-04-18 05:15

【摘要】：本论文以军曹鱼为研究对象,采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR),成功克隆了军曹鱼类胰岛素生长因子-I(Insulin-like Growths Factors-I,IGF-I)基因序列,并对该基因序列进行生物信息学分析和功能鉴定,同时研究了不同饲料糖水平对军曹鱼IGF-I基因组织特异性表达的影响,进而通过质粒重组技术构建了军曹鱼IGF-I体外原核表达系统,并成功获得重组蛋白,为深入研究IGF-I基因对军曹鱼的成长和代谢调控,提供了坚实的理论基础和科学依据。实验结果如下:1.军曹鱼类胰岛素生长生长因子-I(IGF-I)cDNA克隆和序列分析根据已经克隆出的鲈形目鱼类IGF-I基因序列设计简并引物,采用PCR技术成功克隆了军曹鱼类胰岛素生长因子-I序列。其cDNA序列长558bp,编码185个氨基酸,其中信号肽含有44个氨基酸,成熟肽含有67个氨基酸,IGF-I mRNA属于Ea-4亚型。预测分子量为8.58 kDa,理论等电点为7.4。同源氨基酸序列比对分析发现,军曹鱼IGF-I成熟肽结构和人类一样,都包括B、C、A、D区,其中B区和A区保守性较高,C区和D区保守性较差。军曹鱼IGF-I基因与人类的同源性高达74%,与黄鳍棘鲷的同源性高达99%。采用泊松校正法构建的IGF-I系统进化树表明,军曹鱼IGF-I跟海洋鱼类亲缘性较近,跟淡水鱼类和无脊椎动物亲缘性较远。通过实时荧光定量PCR(Real Time PCR,RT-PCR)方法,检测分析IGF-I基因在军曹鱼5个组织中的表达情况,结果发现IGF-I基因在军曹鱼肝脏中表达量最高,在其他组织较低。2.军曹鱼类胰岛素生长因子-I原核表达系统构建根据分析得到的军曹鱼IGF-I成熟肽序列设计引物,克隆得到军曹鱼IGF-I成熟肽,采用pEASY无缝克隆技术将其克隆到pEASY载体上构建pEASY-IGF-I重组质粒,测序正确后,插入表达载体pET-21a,转化到表达菌株Rosetta(DE3)pLysS中进行表达,经IPTG诱导后,表达菌液产生重组蛋白。通过SDS-PAGE检测发现其为分子量为8.6kDa的蛋白条带,经过western blot检测后发现目的蛋白与His抗体特异性结合,表明目的基因IGF-I在大肠杆菌中成功表达。产物以包涵体形式存在,可溶性较差,通过盐酸胍变性,His-Tag纯化和醋酸钠洗脱复性得到可溶性体外重组的目的蛋白。3.军曹鱼进食不同糖水平饲料对IGF-I基因组织表达的影响以糊精为糖源设置三种不同糖水平的饲料饲喂军曹鱼,养殖八周后通过实时荧光定量PCR技术检测IGF-I在各组织中的表达情况,结果发现在中糖组(21%,M),肝脏中IGF-I的表达量是肠道的13倍左右,而低糖组(7%,L)和高糖组(35%,H)的表达量分别是肠道的75倍和470倍,可以得出饲料中糖含量的过高和过低都能影响IGF-I基因在肝脏中的正常表达。
【学位授予单位】：广东海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4

【参考文献】