衔接蛋白Syntenin在日本囊对虾先天免疫中的功能研究

发布时间：2020-04-18 18:01

【摘要】：海洋生物是人类食物的重要来源。对虾是其中一种重要的海水经济养殖动物,然而对虾养殖业易受到多种细菌和病毒的感染,遭受到巨大损失。因此,研究对虾先天免疫机理,不仅可以为防治虾病提供基础理论指导,还能与模式生物的相关研究进行比较,具有重要的理论意义与应用价值。细胞是最小的生命系统组成单位,在其内部的正常活动与秩序的维持中,胞内的衔接蛋白(Adaptor protein)起到不可忽视的作用。其正常的免疫活动,如信号转导,细胞免疫等等,都依赖于接头蛋白才能有条不紊的进行,因此,研究对虾接头蛋白在免疫过程中的功能对于我们进一步了解对虾的先天免疫机制和细胞中衔接蛋白的功能有重要的作用。Syntenin蛋白是一种含有两个串联的PDZ(首次在在突触后密度蛋白PSD-95,DlgA和ZO-1中报道的重复序列)结构域的多功能的胞质内接头蛋白,能够参与到细胞粘附,迁移,分化,凋亡以及在脊椎动物的病毒的免疫反应过程中。但是,目前关于Syntenin蛋白在无脊椎动物的病毒免疫和细菌免疫方面的功能和具体作用机理没有研究。本文选取了日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)做为实验动物,克隆得到了Syntenin的同源基因,命名为MjSyn,并研究了该基因及其编码的蛋白在对虾免疫反应中的功能及其作用机理。MjSyn的cDNA全长共1223bp,其完整开放阅读框为963 bp,共编码320个氨基酸。结构域分析发现MjSyn共包含两个PDZ结构域,一个N端区域和一个C端区域。MjSyn在对虾各个组织中均有分布,并且在受到金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和白斑综合症病毒(white spot syndrome virus, WSSV)刺激后,在不同时间点均有不同程度的上调表达。研究发现,通过RNAi方法干扰对虾体内MjSyn的表达量后,对虾对于细菌感染的清除能力下降了。利用血细胞吞噬荧光细菌的方法,表明干扰MjSyn影响了细胞对于细菌的吞噬能力,进而影响了对虾对细菌的清除能力。通过进一步筛选吞噬相关基因,我们发现干扰MjSyn后,日本对虾中的Calnexin(MjCnx)的mRNA和蛋白的表达都受到抑制,这表明MjSyn可能通过影响calnexin相关途径来影响细胞的吞噬过程。在对虾抗病毒免疫方面的研究中,我们发现干扰MjSyn后,病毒蛋白VP28在对虾体内的复制减少。而过表达MjSyn后,病毒蛋白VP28的复制增加。体外pull-down和体内Co-IP实验证明,全长MjSyn可以结合病毒的囊膜蛋白VP24、 VP28和VP26。全长蛋白中,结构域1+2与结构域C(CTD)都能够分别结合这三种病毒蛋白。另外,实验发现对虾受到病毒刺激后,MjSyn向细胞膜迁移,呈极化分布,F-actin的迁移趋势与MjSyn相吻合,因此两者的共定位增加。值得注意的是,在病毒刺激后的血淋巴中能够检测到分泌出细胞外的MjSyn及VP28蛋白。这些结果表明,MjSyn通过结合病毒蛋白和调控F-actin的分布,促进病毒释放的过程来参与对虾的病毒免疫。
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逦Ｉ逡逑０．１逡逑图３．３不同物种的Ｓｙｎｔｅｎｉｎ系统进化树分析。物种的ＧｅｎＢａｎｋ号标注在相应的物种拉下名逡逑后面，Ａ（／Ｓｙｎ用一个黑色的Ｈ角符号标示。该系统进化树（Ｎｅｒｇｈｂｏｒｉｎｇ－ｊｏｉｎｉｎｇ邋ｔｒｅｅ）用ＭＥＧＡ逡逑４．０软件进行１０００次计算来Ｗ确定结果的可重复性。逡逑Ｆｉｇ邋３．３邋Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ａｎａｌｙｓｅ邋ｏｆ邋ｓｙｎ化ｎｉｎｓ邋ｆｒｏｍ邋ｍｕｌｔｉｐｌｅ邋ｓｐｅｃｉｅｓ．邋Ｔｈｅ邋ＧｅｎＢａｎｋ邋ａｃｃｅｓｓｉｏｎ逡逑ｎｕｍｂｅｒｓ邋ａｒｅ邋ｓｈｏｗｎ邋ｉｎ邋化ｅ邋ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ邋ｔｒｅｅ．邋＿Ａ＾Ｓｙｎ邋ｉｓ邋ｍａｒｋｅｄ邋ｗｉ化邋ａ邋ｂｌａｃｋ邋ｔｒｉａｎｇｌｅ．逡逑Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｍｉｎｇ邋ｔｒｅｅ邋ｗａｓ邋ｃｏｎｓｔｒｕｅ化ｄ邋ｕｓｉｎｇ邋ＭＥＧＡ邋４．０邋ｗｉ化邋ｏｎｅ邋化ｏｕｓａｎｄ邋ｂｏｏｔｓｔｒａｐ邋ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ逡逑化邋ｄｃ化ｒｍｉｎｅ邋化ｅ邋ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ邋ｏｆ邋化ｅ邋ｒｅｓｕｌｔｓ．逡逑３、Ａ＾ｒ’Ｓｙｎ的二级结构预测逡逑用ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ的算法，通过与人类的Ｓｙｎｔｅｎｉｎｌ进行比对计算得到逡逑卸Ｓｙｎ的ＰＤＺ结构域区域的二级结构模型。预测结果显示ＷＳｙｎ的ＰＤＺ结构域逡逑部分包含两个ａ－螺旋（ａｌ和ａ２），逦及五个Ｐ－折叠（ｐｉ到Ｐ５）（图３．４Ｂ）。但是，逡逑人类的／／ｓＳｙｎ中的ＰＤＺ结构域部分包含两个ａ－螺旋和６个Ｐ－折屒（图３．４邋Ａ）。逡逑将日本囊对邮和人类中的Ｓｙｎｔｅｎｉｎ的ＰＤＺ结构域部分进行氨基酸序列比对发现

４、ＭｙＳｙｎ的重组表达及其在对邮组织中的组成性表达逡逑Ｍ／Ｓｙｎ的全长蛋白在化２１邋（ＤＥ３）中表这，并且经Ｎｉ离子亲和纯化柱纯化逡逑后，效果良好（图３．５Ａ）。带有Ｈｉｓ标签的Ｍｊ’Ｓｙｎ的重组蛋白大小约为３５ｋＤａ。逡逑利用半定量ＰＣ民和实时定量Ｑ－ＰＣＲ邋Ｗ及免疫印迹法检测Ｍｙ’Ｓｙｎ在对化各个逡逑纪织中的表达分布，发现ＭｙＳｙｎ在各个组织中呈组成型表达，尤其是在鲍，肠，，逡逑胃和也中表达量较高（图３．５邋Ｂ和Ｃ）。逡逑Ａ逦Ｈｉｓ－ＳＹＮ逡逑Ａ邋－邋Ｖ；如；４逦Ｂ逦ｆｇｇｉ邋Ｈｆｅｍｏｃｙｔｆｃ逦Ｈ＂ｒｔ逡逑－一邋Ｓ＇］逦ＧＺａＣｉｌｌ逦Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ逡逑ｃ逦＿逦巧邋Ｈ巧ａｔｏｐａｎｃｒｅｊｉｓ邋四邋Ｔｅｓｔｅｓ逡逑Ｍ邋Ｉ邋皂邋２－簿四Ｊ邋Ｓｔｏｍａｃｈ逦四邋Ｏｖｔｒｙ逡逑逦＂邋｝｜邋Ｉ邋ｒｆｌｈ邋灥逡逑霉Ｓ邋—…，ｓ邋ｐ＇邋｜逦ｆ｜｜邋ａ逡逑一…

本文编号：2632371