虹鳟鲁氏耶尔森菌分离鉴定及其灭活疫苗的免疫效果评价

发布时间：2020-05-05 01:30

【摘要】：鲁氏耶尔森菌为耶尔森菌属之一,该菌为冷水鱼暴发细菌性败血症的常见致病菌,水产养殖中该菌引发鱼类死亡率较高,给水产养殖产业造成了较严重的经济损失。2013年在青海及北京房山冷水鱼养殖基地从患病虹鳟鱼肝脏和脾脏均分离到此种致病菌,患病虹鳟出现吻端红肿、体表出血、有红色囊肿包裹肛门等临床病症,内部脏器官均有不同程度的病变,根据此症状初步判断其为肠炎红嘴病。从分离得到的致病中选取致病性较高的一株进行进一步试验研究,该菌株命名为BH1206株。目前该病已成为冷水鱼养殖的一种多发性疾病,因此,有必要对该疾病病原学及其防控进行深入研究,为虹鳟肠炎红嘴病的防治提供理论基础。本研究在无菌条件下,从患病未发现寄生虫虹鳟鱼的肝脏和脾脏采用胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)分离并纯化出一株命名为BH1206的致病性菌株。并用该菌对健康虹鳟进行人工感染试验表明,BH1206株为患有肠炎红嘴虹鳟的病原菌。对健康虹鳟鱼进行阶梯浓度致病菌的人工感染试验,来确定该菌的半致死浓度(LD50);对患病虹鳟鱼的肝脏、脾脏、肾脏等组织器官进行病理切片,并观察病变部位和致病部位;对菌落形态观察与并用生理生化试验以及16S r RNA测序、构建系统发育树,确定该致病的分类地位;控制不同的温度、盐度、p H三个培养因素来确定该菌的最适合生长条件;采用扩散法(K-B法)进行药敏试验,明确该菌对抗生素的敏感程度;采用注射免疫和浸泡免疫两种方法对虹鳟鱼进行灭活苗免疫,并通过攻毒实验确定其免疫保护率。试验结果如下:(1)从患病虹鳟鱼肝脏和脾脏分离纯化到一株高致病性菌并命名为BH1206株,通过普通生化试剂管、API 20E试剂盒、Biolog系统以及16Sr RNA分子测序鉴定,确定该菌为鲁氏耶尔森菌。通过控制温度、盐度、p H三个方面明确BH1206株在温度低于15℃及高于40℃环境下不生长,在28℃-30℃生长状态最佳,在p H6-p H10范围内生长,在p H6.5-p H7.5范围内生长状态最佳,Na Cl含量在3%内生长并且Na Cl含量为0生长状态最佳。(2)药敏试验结果表明BH1206菌株对利福平、多粘菌素、阿莫西林完全耐药,对复方新诺明、庆大霉素、卡那霉素、羧苄青霉素、强力霉素、诺氟沙星、氨苄西林、青霉素、链霉素、四环素、环丙沙星、左氧氟沙星、红霉素、氧氟沙星、恩诺沙星、氯霉素、呋喃唑酮、新霉素均有不同程度的敏感,对氨苄西林、青霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、新霉素和呋喃唑酮中度敏感;对红霉素、利福平、阿莫西林、多粘菌素B不敏感。(3)攻毒试验及数据分析得到BH1206的半致死浓度为6.46×107CFU/m L,病理组织切片中可以观察到肝脏和脾脏细胞坏死,产生大量的炎症细胞,肠道组织极度萎缩变形,肾脏也有明显病变。(4)免疫试验结果表,300℃d?后浸泡免疫组1×109cells/m L菌液的免疫保护率为75.0%,浸泡免疫组1×107cells/mL菌液的免疫保护率为71.16%,浸泡组对照组的免疫保护率为3.53%;注射免疫组1×109cells/m L菌液的免疫保护率为89.09%,注射免疫组1×107cells/mL菌液的免疫保护率为85.45%,该组对照组免疫保护率为5.45%,两种免疫方式均提高了其免疫保护率,其中注射免疫组免疫保护力较高。试验得到以下结论:从患病虹鳟鱼病灶部位分离的菌株BH1206经试验分析确定为鲁氏耶尔森菌,是虹鳟肠炎红嘴病的病原菌。鲁氏耶尔森菌BH1206甲醛灭活苗应用腹腔注射进行免疫,达到一定得免疫效果,其免疫保护率达到89.09%。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S943

【参考文献】