诱导型表达囊膜蛋白VP088的重组石斑鱼虹彩病毒构建及其对病毒感染的影响

发布时间：2020-05-05 15:53

【摘要】：新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)是我国南方石斑鱼养殖产业中的一种重要病毒性病原,近年频繁爆发给水产养殖业带来了重大经济损失。在前期对SGIV分离、鉴定的基础上,我们对其基因组、转录组、蛋白质组进行了研究,结果表明SGIV ORF088编码的一个囊膜蛋白,初步实验揭示其可能在SGIV的黏附和侵入等过程中发挥重要作用,但是其在病毒感染过程中的具体作用机制尚不清楚。本研究利用重叠PCR和多片段同源重组等技术成功构建了含有乳糖操纵子系统的SGIV ORF088诱导型表达重组病毒(Recombiannt virus 088, RV-088),通过IPTG诱导调控VP088基因的表达与缺失。分别通过嘌呤霉素筛选、流式细胞仪分选及连续梯度稀释挑斑法进行重组病毒的纯化。获得纯化重组病毒后,病毒滴度实验表明,未加IPTG诱导的重组病毒(RV088-IPTG)比加入IPTG诱导的重组病毒(RV088+IPTG)的滴度显著降低。进一步基因转录分析表明,MCP、ORF136(LITAF)、ORF088、ORF086(ICP18)的转录表达水平也显著降低。尽管电镜观察结果表明,RV088-IPTG的病毒结构形态与RV088+IPTG没有显著变化,但是对病毒的进入特征研究表明,RV088-IPTG在病毒感染2h后进入的数量显著少于RV088+IPTG,由此推测VP088在SGIV病毒进入过程中可能发挥关键作用。综上结果表明,我们成功建立用IPTG诱导含有乳糖操纵子系统的重组石斑鱼虹彩病毒,为后期研究病毒的基因功能提供一种新的策略。在研究参与病毒进入,装配或释放过程中的病毒囊膜蛋白的同时,我们还尝试寻找参与病毒感染的宿主蛋白。在纯化SGIV病毒并进行病毒蛋白质谱鉴定的过程中,我们发现有7种宿主细胞蛋白,包括细胞骨架微丝肌动蛋白actin能够在提纯病毒过程中和病毒蛋白同时被纯化,并且western印迹实验证实actin在纯化病毒中存在,由此推测actin可能在病毒装配或释放过程中发挥重要作用。进一步免疫荧光实验结果表明,在病毒感染晚期,细胞变圆,大部分细胞微丝actin蛋白聚集到细胞表面,并且和SGIV病毒共定位。而且通过电镜观察表明,SGIV在装配完成后,需要获得宿主细胞质膜成分才释放形成完整的有囊膜的病毒颗粒。上述结果为actin在在病毒装配与释放过程中发挥着作用提供了一个佐证。接下来对actin和病毒蛋白相互作用的研究将进一步揭示actin在病毒侵染中的作用机制。
【图文】：

示意图,痘病毒,基因功能,阻遏蛋白

何利波等在鉴定ＲＧＶ邋ＴＫ和５３Ｒ等基因功能的基础上，也分别构建出缺失逡逑胸苷激酶（ＴＫ）基因和可诱导性表达５３Ｒ的重组蛙病毒Ａ邋ＴＫ－ＲＧＶ及逡逑ｉ５３Ｒ－ＲＧＶ－ｌａｃＩＯ如图１．３（Ｈｅ邋ｅｋ／．，２０１２）。其最为主要的原件是阻遏蛋白和操纵逡逑子，阻遏蛋白能够与操纵子序列特异性结合，覆盖启动子区域，从而阻止了乳逡逑糖操纵子的基因转录（Ｂｅｌｌ邋ＣＥ，Ｌｅｗｉｓ邋Ｍ邋ｅ／邋ｄ邋，邋２０００）。除了能够与ＩａｃＯ序列结合逡逑６逡逑

示意图,虹彩病毒,病毒,生物信息学

逦ｌａｄ逦ｇ＿ｐｔ邋ＩａｃＯ逦Ｊ１Ｒ逡逑图１．邋２利用重组痘病毒研宄基因功能示意图（Ｃｈｉｌｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，２００２）。逡逑（Ａ）构建了一株可以表达Ｔ７聚合酶的重组病毒Ｖｔ７１ａｃＯＩ。用病毒早期启动子启动ｌａｄ逡逑的表达，病毒晚期启动子与ＩａｃＯ序列结合，用于启动Ｔ７的表达。上述原件均插入病毒ＴＫ逡逑基因中。（Ｂ）在病毒基因组上插入外源性的Ｊ１Ｒ基因。将外源性的Ｊ１Ｒ基因和抗性筛选基因逡逑插入病毒Ｖｔ７１ａｃＯＩ的非必须基因Ａ５６Ｒ上，构建了一株重组病毒ＶｊｌＲ／ＩＪｌＲ。（Ｃ）构建重组逡逑病毒ｖｉＪＩＲ。此病毒本身的Ｊ１Ｒ基因被ｌａｃＺ基因取代，插入的外源基因的Ｊ１Ｒ基因收ＩＰＴＧ逡逑的调控，其表达依赖于ＩＰＴＧ。逡逑Ｆｉｇ邋１．邋２邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｇｅｎｅ邋ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ邋ｂｙ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｖａｃｃｉｎｉａ逡逑ｖｉｒｕｓ．邋（Ｃｈｉｕ邋ｅｔ邋ａｌ．
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S941.41

【参考文献】