中华绒螯蟹促性腺激素释放激素受体（GnRHR）同系物的克隆及其表达特征

发布时间：2020-05-07 03:55

【摘要】：作为促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)信号通路的重要的成分,GnRH受体(GnRHR)和GnRH结合,然后在刺激一系列的激素级联反应调控性腺的发育中起到重要的作用。目前,本实验室已从中华绒螯蟹脑和卵巢转录组库中筛选出GnRH信号通路的相关基因,筛选出的这些基因的序列与大多数昆虫类以及其他甲壳类动物的基因序列有较高的相似性。并且,我们实验室已经成功分离出中华绒螯蟹GnRH类似物。目前,关于中华绒螯蟹GnRHR基因的研究仍为空白。同时为了研究在无脊椎动物中GnRHR的分子机制以及潜在GnRH信号通路,本实验选取了我国重要的水产类品种中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)作为对象,研究在无脊椎甲壳动物中促性腺激素释放激素受体的分子鉴定和表达。在为了检测GnRHR分布特征,本实验中,首先在中华绒螯蟹Eriocheir sinensis(命名为EsGnRHR)中克隆得到了GnRHR cDNA序列并对其表达特征进行了分析。EsGnRHR全长为2038 bp,包括一个1566 bp的开放阅读框,57 bp的5′端非编码区和415 bp的3′端非编码区。结构域预测显示EsGnRHR蛋白质包括7个跨膜α螺旋结构域,该特征符合在脊椎动物中已经鉴定得出的促性腺激素释放激素受体。聚类进化树分析说明中华绒螯蟹促性腺激素释放激素受体和无脊椎动物日本沼虾(Macrobrachium nipponense)的亲缘关系比较近。其次RT-PCR检测了EsGnRHR基因在中华绒螯蟹成体中各个组织中的表达情况,结果发现,EsGnRHR表达主要分布在胸神经团、卵巢中,有少量分布在精巢和脑中。然后原位杂交验证EsGnRHR mRNA的分布,EsGnRHR mRNA杂交信号主要分布在脑组织的前部和中部。在卵巢组织中,信号主要分布在卵黄发生前期的细胞质和卵黄发生期细胞中的分散细胞质中;同时在精巢组织中,EsGnRHR mRNA主要分布在精巢的精母细胞和精母细胞中,这些结果显示GnRHR基因确实存在于中华绒螯蟹体内。最后实时荧光定量PCR分析不同的性腺发育的阶段的表达情况,EsGnRHR mRNA的表达量在精巢和卵巢发育时期中的数据说明EsGnRHR参与调控性腺的发育。最后,荧光定量分析注射中华绒螯蟹GnRH类似物多肽对EsGnRHR mRNA表达的影响,结果显示,EsGnRHR表达水平在雄性中华绒螯蟹在15 d(day)出现显著性差异,雌性中华绒螯蟹中在24 h(hour)和7 d时间点均有显著性差异,这些数据说明GnRH多肽类似物能够刺激EsGnRHR的表达。总之,本实验结果第一次证明了GnRHR存在于中华绒螯蟹中。对EsGnRHR基因分子特性进行了系统分析,并对其与其他物种的进化关系进行了研究。EsGnRHR mRNA分布在胸神经和性腺。进一步的研究证明,EsGnRHR mRNA在精巢整个发育时期,卵巢的早、中期有表达,说明了EsGnRHR具有多种功能。虽然需要进一步的探索,但是我们关于EsGnRHR的研究为中华绒螯蟹脑-胸神经团-性腺轴的研究提供了理依据。
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上海海洋大学硕士学位论文两者的中间部分 933 bp 如图 1-1，使用拼接和 RACE 方法，我们从中华绒螯蟹的脑和卵巢中克隆得到了 GnRHRcDNA。利用 BCNI 进行 BLAST，结果显示为中华绒螯蟹 GnRHR 基因。最终确定 cDNA 的全长为 2038 bp,包括 57 bp 的 3′-UTR 和5′-UTR 415 bp 的 UTR，包括得到了 1566 bp 得 ORF，编码 521 个氨基酸，为了进一步验证该基因的拼接全长的正确性，设计 F 和 R 引物，PCR 扩增PCR 的扩增结果为 1000-2000bp 左右，符合全长的大小,送上海生工公司进行测序,并对测序结果进行分析，证明为 GnRHR 基因的序列。

模式图,三级结构,模式图,中华绒螯蟹

白质结构分析线工具 ProtParam 预测中华绒螯蟹 GnRHR 的理编码 521 个氨基酸。预测的分子质量为 59451.62Da数为 50.53。溶脂数为 90.9，总平均疏水指数 0.07具NetPHos2.0预测GnRHR蛋白质的潜在得磷酸化9 个丝氨酸磷酸化位点，4 个苏氨酸磷酸化位点以及RED 在线网址预测保守结构域对中华绒螯蟹 GnRH，结果如图 1-7 所示，存在 7 个分值大于 0 的峰，，分别为位于 1-17、33-54、71-88、107-127、16氨基酸。另外，，中华绒螯蟹 GnRHR 基因的第三和-x-G/S 氨基酸调控位点，这表明该受体基因或许还跨膜结构域。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4

【参考文献】