密码子优化后的金鱼Tgf2转座酶的原核表达、纯化及其酶活性研究

发布时间：2020-05-07 09:20

【摘要】：转座子(transposon)是一类可以在基因组中改变插入位置的遗传因子,能够通过水平转移(horizontal transfer)的方式在自然界的不同物种间扩散传播。转座子所编码的活性转座酶能够启动其在生物体内的转座过程,然而脊椎动物中的一些转座子由于突变等原因大多数均已失去活性,成为了非自主性转座子,从而不能完成整个转座过程。2008年,在不同的金鱼品系中通过筛选,最终获得金鱼Tgf2转座子,它是继第一类具有自主转座活性的青溕Tol2之后的第二类具有自主转座活性的转座子,属于hAT(hobo-AC-Tam)超家族。Tgf2转座子能够编码完整、具有自主转座活性的转座酶,在鱼类转基因、基因捕获等方面具有广阔的应用前景。本实验室从金鱼胚胎中分离得到了7种不同的Tgf2转座子mRNA转录本,同时得到了三种氨基酸长度分别为686、650和577的Tgf2转座酶。目前这三种长度的转座酶均已在E.coli中表达,为了进一步提高表达量及其表达稳定性,依据大肠杆菌对密码子的偏好性和简并性对686长度的转座酶密码子进行了优化。本研究目的则是利用pET28a(+)作为质粒载体,E.coli BL21(DE3)作为宿主菌,表达出密码子优化后的686长度Tgf2转座酶,并研究能够保存纯化后的转座酶稳定性的方法。同时用含有不同重复序列数目的探针研究其DNA结合活性及特异性,从而为构建具有更高活性的转座酶提供帮助。本实验主要分为四个部分。第一部分为重组表达载体的构建,首先依据大肠杆菌对密码子的简并性和偏好性对金鱼Tgf2转座酶的密码子进行优化,优化后的Tgf2转座酶命名为Tgf2-TPase~(83)。用限制性内切酶Bam I和XholI分别对含有Tgf2-TPase~(83)基因序列的克隆载体和表达载体pET28a(+)双酶切,用T_4 DNA连接酶将它们连接起来。根据转座酶和载体的特点设计合适的引物,PCR检测,用基因测序方法鉴定连接后的序列,序列对比结果表明,重组表达载体pET28a(+)-Tgf2-TPase~(83)构建成功。第二部分为重组载体pET28a(+)-Tgf2-TPase~(83)的原核表达、纯化和质谱鉴定。本实验中选择BL21(DE3)作为表达的宿主菌,使得重组载体质粒在BL21(DE3)中表达,表达条件为温度30℃、IPTG浓度1.0 mM、诱导时间6 h、转速150 rpm,用SDS-PAGE(SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析。实验结果表明,在蛋白分子量大约为79.6 kDa处不但有相应的条带出现,而且表达后此处的蛋白条带有明显加深,所以目的蛋白表达成功。在SDS-PAGE中可以表达出可溶性蛋白,故我们采用反复冻融、超声破碎、离心取上清的方法用His Trap~(TM) HP柱子对重组蛋白纯化,分别用20 mM、40 mM、500 mM的咪唑对目的蛋白进行洗脱,将最终收集的纯化样品用SDS-PAGE分析,割胶并进行质谱鉴定。结果表明,密码子优化后的Tgf2-TPase~(83)表达量提高到了6.3%,纯度提高到了85%。同时,质谱结果表明,重组蛋白Tgf2-TPase~(83)即为金鱼Tgf2转座酶。第三部分为重组蛋白Tgf2-TPase~(83)的保存稳定性研究。本实验中选取了四种不同的保存方法,分别为:加入20%甘油、直接冻干、加入冻干保护剂8%蔗糖和4%甘露醇后冷冻干燥,均置于-80℃中进行保存。用质粒pTgf2-EF1α-EGFP检测分别保存7 d和14 d后Tgf2-TPase~(83)的DNase活性,用琼脂糖凝胶电泳检测,通过BandScan扫描,将质粒的变化情况进行量化处理,得到不同的消化速度。结果表明,以新鲜酶液的DNase活性作为对照,20%甘油有助于保存Tgf2-TPase~(83)酶活性,其他三种保存方法都没有20%甘油的保存效果好。第四部分为重组蛋白Tgf2-TPase~(83)的DNA结合活性及其特异性研究。首先,对用20%甘油保存的Tgf2-TPase~(83)酶进行DNA结合活性研究;其次,金鱼Tgf2转座子的重复序列包括5’AGTAA3’和5’GTACT3’,我们从Tgf2转座子左臂末端设计了四种含有不同重复序列数目的探针,分别为P_H,P_(M1),P_(M2),P_L,其中探针P_L中包含有与原始重复序列不同的碱基为5’GGTAA3’。实验中我们用葡聚糖凝胶层析来判断Tgf2-TPase~(83)是否具有DNA结合活性,主要是根据蛋白与探针结合后的紫外吸收值是否有增加。同时,用蛋清溶菌酶作为阴性对照,判断Tgf2-TPase~(83)的DNA结合活性是否具有特异性。结果表明,用20%甘油保存7 d、14 d、30 d时的Tgf2-TPase~(83)酶是具有DNA结合活性的;含有不同重复序列数目的探针与重组蛋白Tgf2-TPase~(83)的DNA结合活性是不同的,重复序列数目越多,其结合活性越高。另外,阴性对照实验结果表明,Tgf2-TPase~(83)的DNA结合活性是具有特异性的。通过密码子优化后的Tgf2转座酶不仅增加了其表达量(6.3%),而且纯化后其纯度(85%)也得到了提高。采用原核表达系统获得的可溶性重组蛋白Tgf2-TPase~(83)不仅为鱼类转基因提供了更加有效的手段,而且也促进了转座子基因捕获、基因捕获和鱼类遗传育种等方面的应用。
【图文】：

密码子,稀有密码子,转座酶

上海海洋大学硕士学位论文时出现差异，即为密码子偏爱性。同时，也存在着一定的简并性。从 19 中不同鱼类物种和品系中筛选出来金鱼 Tgf2 转座子，其转座酶（Tgf2-TPase）中含有一些稀有密码子，使大肠杆菌难以识别，如 AGA，UCG，AGG 等。我们使用稀有密码子分析工具（GeneScript Rare Codon Analysis Tool）可知：Tgf2-TPase 的密码子使用频率分布系数（Codon Frequency Distribution,CFD），GC 含量和密码子适应指数（CodonAdaption Index,CAI）分别为：1%，51.28%和 0.83。参考大肠杆菌对密码子的两种特性，我们对 Tgf2-TPase 包含的稀有密码子进行了优化，如图 1-1 所示，使得 CFD，CAI 和 GC 同时达到了理想区间指标。Tgf2-TPase 转座酶包括 686个氨基酸，长度为 2061 bp，密码子共优化 83 处，19 种不同的氨基酸。

产物,电泳,片段,目的

图 1-2 Tgf2-TPase83的双酶切电泳检测A 标准分子量 marker；1：Tgf2-TPase83的双 1-2 Double enzyme cutting detection of Tgf2-TP marker; 1: Double enzyme cutting product of Tg得本身含有的 XhoI 与 BamHI 酶切位点，用目的片段大小为 5369 bp。检测电泳如行割胶回收。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78;S917.4

【参考文献】