马氏珠母贝乙酰胆碱受体和IL-17基因鉴定及功能分析

发布时间：2020-05-08 13:57

【摘要】：神经递质乙酰胆碱通过胆碱能免疫调节系统抑制炎症因子的释放,参与调控机体的免疫反应。本研究通过分析已发表基因组序列,对马氏珠母贝胆碱能免疫调节系统中的重要组成分子乙酰胆碱受体(Nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)和炎症细胞因子白细胞介素17(interleukin-17,IL-17)基因进行鉴定,并采用多种生物信息学和分子生物学方法对其功能进行初步分析。主要研究结果如下:1、乙酰胆碱受体的鉴定及比较分析:与脊椎动物(人和斑马鱼)相比,乙酰胆碱受体基因在软体动物、环节动物以及腔肠动物中均出现大量扩张现象。相较于腹足类和头足类,nAChRs在5种双壳类(马氏珠母贝、长牡蛎、虾夷扇贝、深海偏顶蛤和菲律宾偏顶蛤)中的扩张最为明显,数量在99到217之间,在马氏珠母贝中数量最多,有217个。内含子-外显子结构分析显示,软体动物nAChRs基因中广泛存在intronless基因,马氏珠母贝nAChRs基因中有120个intronless基因。此外,在软体动物中还存在大量串联重复的nAChRs基因,在马氏珠母贝中有140个为串联重复基因。综上,软体动物中的nAChRs出现大量扩张,可能是由于逆转录转座和串联复制引起。2、nAChRs序列变异分析:马氏珠母贝中nAChRs基因的序列长度和结构域组合均呈现多样化,其配体结合结构域(ligand-binding domain,LBD)序列变异度较大。在马氏珠母贝中鉴定到27个α型nAChRs,其中有15个基因的配体结合处的关键氨基酸发生变异或缺失,在长牡蛎中也观察到同样的现象。同源建模结果显示马氏珠母贝中6个α型nAChRs基因缺失α1螺旋,5个基因β折叠缺失,其中Pm448.7、Pm10013868和Pm10016494同时缺失α1螺旋和β折叠。Pm10031648的跨膜区的M4和MX螺旋缺失。此外,15个α型nAChRs的Loop A和Loop C中的Tyr残基出现缺失或替换。例如:Pm10031648、Pm448.7和Pm10016494等基因Loop A结构中的Tyr残基缺失。3、nAChR的功能分析:马氏珠母贝、长牡蛎和虾夷扇贝发育不同时期的转录组分析发现,马氏珠母贝中4个nAChRs在受精卵中特异性高表达,32个nAChRs在D型幼虫阶段高表达,还有一些nAChRs在其他发育阶段特异性高表达。长牡蛎和扇贝中nAChRs在发育不同时期的表达模式与马氏珠母贝相似。与长牡蛎、虾夷扇贝、深海偏顶蛤、菲律宾偏顶蛤不同组织的转录组分析结果类似,nAChR在马氏珠母贝外套膜和鳃中特异性高表达。通过基因克隆,共获得了5个nAChRs基因(Pm10012059、Pm10024952、Pm10020990、Pm10008204、以及Pm93.653)的cDNA全长序列。qRT-PCR分析显示,五个基因均在囊胚和原肠胚阶段特异性高表达。Pm10012059、Pm10024952、Pm10020990和Pm10008204的原位杂交结果显示,其均在囊胚、原肠胚及担轮幼虫时期具有明显的阳性信号。此外,三个发育后期特异性表达的nAChRs基因(Pm10029677、Pm10032199以及Pm10000530)均在D型幼虫、眼点幼虫以及变态时期幼虫的软体部有明显的阳性杂交信号。以壳损伤处理后0h、4 h、6 h、12 h、24 h、36 h和48 h的外套膜边缘膜(mantle edge,ME)为材料进行表达谱分析发现,共检测到99个nAChRs(rpkm1)。与对照组(0 h)相比,有41个nAChRs表达量发生显著性上调,15个基因在4 h和6 h显著性上调,10个基因在36 h和48 h显著性上调,4个基因在壳损伤后4 h、36 h和48 h均显著性上调。内含子-外显子结构分析发现,99个nAChRs中内含子数为0-2个的nAChRs基因有58(58.6%)个。4、IL-17基因鉴定及功能分析:与脊椎动物(人和斑马鱼)相比,IL-17基因在软体动物中出现扩张现象。马氏珠母贝中最多,有15个。系统进化分析发现,无脊椎动物中的IL-17聚在一枝。内含子-外显子结构分析发现马氏珠母贝中存在大量intronless IL-17基因,此外,在马氏珠母贝中有7(47%)个为串联重复基因。马氏珠母贝不同组织和发育阶段的转录组分析显示PmIL-17的表达具有组织和发育阶段特异性。PmIL-17-2与PmIL-17-4具有相似的表达模式,均在眼点幼虫和中央膜中高表达,PmIL-17-7在担轮幼虫和性腺中高表达。PmIL-17-10基因在稚贝和鳃中高表达,PmIL-17-12则在D型幼虫、鳃和肝胰腺中表达量较高,而PmIL-17-13则在原肠胚和边缘膜中高表达。以上研究表明,nAChR和IL-17基因在马氏珠母贝中发生大量扩张,这种扩张可能是由于串联重复以及逆转录转座形成,并且基因扩张导致nAChRs和IL-17的序列变异和功能分化。
【图文】：

胆碱能,信号通路,转录因子

软体动物乙酰胆碱受体和 IL-17 基因鉴定及功能分析JAK2 是调剂免疫反应中必须的络氨酸激酶，当 Tyr1007/1008 磷酸化时，会引起脓毒症早期的炎症反应[12-16]。STAT3 被认为是一种关键的抗炎转录因子，磷酸化的 JAK2 通过 Tyr705 的磷酸化激活转录因子 STAT3；而磷酸化的 STAT3 进入细胞核，导致转录反应，这对于 IL-6 和 IL-10 等促炎细胞因子的产生至关重要[17]。然而，STAT3 是间接地发挥其抗炎作用，并且不直接抑制促炎基因如 TNF，iNOS以及 IL-6 的转录[18]。最可能的是，nAChR 活化通过激活 Jak / STAT 信号传导干扰其他信号传导途径和转录因子，例如 NF-κB 或 TGF-β[19; 20]。目前研究表明，NF-kB p65 同源二聚体在激活时募集并与 STAT3 结合，因此，NF-κB 和 Jak/STAT途径可以协同传递炎症信号，共同抑制促炎因子的产生[17; 21-23]。

物种,数目,帽贝,海兔

ttp：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）绘制 nAChR 的外析、牡蛎、帽贝、海兔、海蠕虫、水蛭、珊瑚、数据为基础，根据基因家族成员在染色体上的基因的串联重复情况。体基因的鉴定库下载了帽贝、海兔、章鱼、水蛭、海蠕虫、terProSca，Nr 和 KEGG 的注释信息，并使用母贝等 17 个物种中的 nAChRs 进行全基因组鉴体动物，，环节动物及腔肠动物中出现大规模扩扩张最为明显，数量在 99 到 217 之间。在马氏蛎中 132 个。
【学位授予单位】：广东海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S917.4

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