弧菌金属蛋白酶Epp和β-内酰胺酶VPBL的结构与功能研究
发布时间：2020-05-09 07:54
【摘要】：弧菌是一类弯曲或直杆状的革兰氏阴性细菌,其中一些种类可以引起养殖动物的疾病,甚至可以引起人的疾病导致死亡。致病性弧菌拥有多种毒力因子,胞外蛋白酶是主要组成成分,对弧菌的致病性具有重要作用。弧菌普遍对β-内酰胺类抗生素具有抗性,主要机制之一是产生β-内酰胺酶,降解β-内酰胺类抗生素。本论文对鳗弧菌胞外蛋白酶Epp的PKD1结构域和副溶血弧菌β-内酰胺酶VPBL开展了结构与功能研究。胞外蛋白酶一般以酶原前体的形式表达出来,然后经过多步加工成熟。金属蛋白酶EmpA是鳗弧菌的一种重要毒力因子,其成熟需要该酶成功的分泌和加工,而一种蛋白酶Epp被发现可以促进胞外的pro-EmpA加工为成熟的EmpA。Epp与霍乱弧菌金属蛋白酶PrtV具有高度的相似性,全长包含信号肽、N端结构域、M6金属蛋白酶结构域和两个PKD结构域(分别命名为PKD1和PKD2)。PrtV的PKD1的结构已经被解析,Ca~(2+)可以通过结合PKD1结构,控制PrtV酶原的结构域连接区域灵活性来调节成熟过程。因此Epp也可能会通过PKD1结构受Ca2+调控成熟,但是具体激活机制完全未知。由于Epp的M6金属蛋白酶结构域没有获得可溶性蛋白,因此本研究中我们只解析了鳗弧菌Epp蛋白酶的第一个PKD的结构(Epp-PKD1)以及研究了它Ca~(2+)结合的特异性。Epp-PKD1在溶液中以单体形式存在,结构主要是七个β-折叠构成的两个β-片层,每个蛋白分子的N3、Q4、D27、D29、D68和一个水分子与Ca~(2+)形成五角双锥体的构象。Ca~(2+)与apo Epp-PKD1孵育可以促进蛋白的热稳定性和化学稳定性,而Mg~(2+)、Mn~(2+)和Zn~(2+)都不可以,显示Epp-PKD1结合Ca~(2+)具有特异性。尽管Epp-PKD1与PrtV-PKD1在序列和结构上有高的同源性,但是两者在多聚状态和Ca~(2+)结合位点是不同的,说明PrtV和Epp受Ca~(2+)调控成熟是不同的。我们的研究有助于更好地理解PKD结构域介导的Ca~(2+)调控蛋白酶的成熟过程。β-内酰胺类抗生素是治疗细菌感染使用最广泛的抗生素,具有毒性小、成本低、抗菌活性广、临床疗效好等优点。然而,细菌会进化出各种耐药性机制,阻碍其应用。染色体编码的β-内酰胺酶是副溶血弧菌抗β-内酰胺类抗生素的主要原因,在这里我们首次解析了副溶血弧菌的A类β-内酰胺酶VPBL的晶体结构。VPBL结构由两个结构域组成,一个是α/β结构域,包括5个反向平行的β折叠和3个α螺旋,另一个是主要由α螺旋组成的α结构域。活性位点位于两个结构域之间,主要由四个保守序列_(70)STFK_(73)、_(130)SDN_(132)、_(166)ExxLN_(170)、_(234)KTG_(236)组成。与已知的A类β-内酰胺酶相比,VPBL包含一个保守的活性位点,但在远离活性位点的位置存在氨基酸的差异,这在一定程度上影响酶的催化活性。与其他β-内酰胺酶和底物复合物的比较揭示了该酶对底物和抑制剂结合的偏好性,与酶活性相互印证。我们的结果支持了β-内酰胺酶抑制剂可与β-内酰胺类抗生素结合共同用于治疗副溶血弧菌感染的这种新策略。同时我们进行定向进化研究了该酶的可塑性,发现VPBL具有较好的可塑性,可以通过氨基酸替换形成对抑制剂的抗性,这些突变可以协同作用增加抑制剂的抗性。因此仔细监测酶突变对于β-内酰胺酶抑制剂与β-内酰胺类抗生素组合治疗感染是必要的。β-内酰胺酶是该策略的关键,所以对β-内酰胺酶结构和可塑性的研究有助于β-内酰胺类抗生素和β-内酰胺酶抑制剂组合在治疗弧菌中的应用。另一方面,这些结果也提供给我们结构信息来设计β-内酰胺类抗生素和抑制剂治疗弧菌感染。
【图文】：
基因、四环素耐药基因 (Charles andAnthony, 2017)。（V.anguillarum）属于弧菌属、弧菌科，端生鞭毛，非孢子氧(Madigan et al., 2000; Buller, 2004)(图 1.1)。该菌在含有 1.培养基上，在 25-30℃的温度下可以快速生长，形成奶油色鳗弧菌分为两种不同的生物类型 (1 型和 2 型) (Harrell et al技术的进步，鳗弧菌 2 型被重新归类为新物种 Vibrio ordalii。基于 5S rRNA 基因序列分析，鳗弧菌 1 型被重新分类为 (MacDonell and Colwell, 1985)。然而，由于它与其他弧菌紧被称为 V. anguillarum (Wiik et al., 1995)。例如，鳗弧菌与溶和费氏弧菌的 16SrRNA 基因显示有超过 95%的相似性，这个属的依据 (Wiiket et al., 1995; Clarridge 2004)。
胞外的 pro-EmpA 加工成熟为 EmpA。基因 epp 编码了一种 918 个氨基酸的酶，与先前报道的 V. cholerae 金属蛋白酶 PrtV 和其他假定蛋白酶具有高度似性（如表 1.3）。PrtV 的成熟是由 Ca2+调控的 (Aaronetal.,2014)，，PrtV 的白酶原包含信号肽、N 端结构域、M6 金属蛋白酶结构域和两个 PKD 结构别命名为 PKD1 和 PKD2)（如图 1.2）。PrtV 全长 102 kDa，分泌到胞外时信号肽和 PKD2 结构域形成 81 kDa 的形式，Ca2+调节蛋白水解形成 55kD性复合物，包含两个 18 kDa 和 37 kDa 的蛋白链。PrtV 中 PKD 结构域的功不完全清楚，但 PrtV 的成熟需要除去两个 PKD 结构域。PKD1 的结构已经析，Ca2+可以通过结合 PKD1 结构，控制 PrtV 酶原的结构域连接区域灵活调节成熟过程 (Aaron et al., 2013)。PKD1 失去 Ca2+后与金属蛋白酶结构域区域的柔韧性增加从而断裂，使 PrtV 的金属蛋白酶结构域结构进一步降解成熟，然而 PKD1 结构域的功能仍然不是很清楚，需要进一步研究。
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S941.42
本文编号：2655832
【图文】：
基因、四环素耐药基因 (Charles andAnthony, 2017)。（V.anguillarum）属于弧菌属、弧菌科，端生鞭毛，非孢子氧(Madigan et al., 2000; Buller, 2004)(图 1.1)。该菌在含有 1.培养基上，在 25-30℃的温度下可以快速生长，形成奶油色鳗弧菌分为两种不同的生物类型 (1 型和 2 型) (Harrell et al技术的进步，鳗弧菌 2 型被重新归类为新物种 Vibrio ordalii。基于 5S rRNA 基因序列分析，鳗弧菌 1 型被重新分类为 (MacDonell and Colwell, 1985)。然而，由于它与其他弧菌紧被称为 V. anguillarum (Wiik et al., 1995)。例如，鳗弧菌与溶和费氏弧菌的 16SrRNA 基因显示有超过 95%的相似性，这个属的依据 (Wiiket et al., 1995; Clarridge 2004)。
胞外的 pro-EmpA 加工成熟为 EmpA。基因 epp 编码了一种 918 个氨基酸的酶，与先前报道的 V. cholerae 金属蛋白酶 PrtV 和其他假定蛋白酶具有高度似性（如表 1.3）。PrtV 的成熟是由 Ca2+调控的 (Aaronetal.,2014)，，PrtV 的白酶原包含信号肽、N 端结构域、M6 金属蛋白酶结构域和两个 PKD 结构别命名为 PKD1 和 PKD2)（如图 1.2）。PrtV 全长 102 kDa，分泌到胞外时信号肽和 PKD2 结构域形成 81 kDa 的形式，Ca2+调节蛋白水解形成 55kD性复合物，包含两个 18 kDa 和 37 kDa 的蛋白链。PrtV 中 PKD 结构域的功不完全清楚，但 PrtV 的成熟需要除去两个 PKD 结构域。PKD1 的结构已经析，Ca2+可以通过结合 PKD1 结构，控制 PrtV 酶原的结构域连接区域灵活调节成熟过程 (Aaron et al., 2013)。PKD1 失去 Ca2+后与金属蛋白酶结构域区域的柔韧性增加从而断裂，使 PrtV 的金属蛋白酶结构域结构进一步降解成熟，然而 PKD1 结构域的功能仍然不是很清楚，需要进一步研究。
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S941.42
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1 李培海;弧菌金属蛋白酶Epp和β-内酰胺酶VPBL的结构与功能研究[D];中国科学院大学(中国科学院海洋研究所);2018年
本文编号：2655832
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