凡纳滨对虾卵巢发育差异表达基因的克隆与mRNA相对表达量分析

发布时间：2020-05-15 05:55

【摘要】：对虾在人工控制条件下卵巢难以发育成熟,一直是对虾育苗生产中的难题。虽然采用眼柄切除的方法可以促进亲虾发育、成熟,但是这种方法直接损害亲虾健康,影响卵子质量。因此探索对虾卵黄发生调控机理,弄清影响卵巢发育的内外因子是当前对虾繁殖与发育生物学的研究热点和重要课题。本研究以凡纳滨对虾为研究对象,在通过抑制消减杂交技术筛选出眼柄切除前后差异表达基因的基础上,选择核自身抗原精子蛋白基因和极孔样蛋白基因进行深入研究,为凡纳滨对虾卵巢发育调控机理的研究奠定基础。本实验通过cDNA末端快速扩增技术成功克隆出了核自身抗原精子蛋白基因(nuclear autoantigenic sperm protein,NASP)和极孔样蛋白基因(polehole-like protein,PHL)的cDNA全长序列,并且利用实时荧光定量技术对这两个基因在不同发育时期在卵巢和肝胰腺组织中的表达情况进行了研究。实验结果如下:1)通过RACE技术克隆出的核自身抗原精子蛋白基因全长2058bp,其中包括92 bp 5’端非编码区,147 bp 3’端非编码区及2019 bp开放阅读,编码673个氨基酸,预测分子量为74.18 KD,理论等电点为4.46。该序列已提交至GenBank,序列号为KT274811。在NCBI上进行BLASTN序列比对后发现其与斑节对虾(Penaeus monodon)核自身抗原精子蛋白基因序列(FJ040859.1)相似性最高,为90%。通过生物信息学分析发现,此蛋白序列含有SHNi-TPR和TPR_2两种结构域,且具有4个糖基化位点。此外,通过构建系统进化树比较了凡纳滨对虾NASP与其它物种间的遗传距离,结果显示与班节对虾的序列最接近。采用荧光定量PCR方法测定了其在卵巢与肝胰腺中不同发育时期相对表达水平,结果表明,NASP在卵巢中的表达量显著高于肝胰腺,且在卵巢发育第二期表达量最高,第三期表达量最低,各期之间无显著性差异。NASP的主要功能与细胞分裂、增殖相关。2)通过RACE技术克隆出6343bp极孔样蛋白基因,包括117bp 5’端非编码区,61 bp3’端非编码区及6165 bp开放阅读,编码2054个氨基酸,预测分子量为224.46KD,理论等电点为4.84。该序列已提交至GenBank,序列号为KU981017。通过BASTP比对发现其氨基酸序列与斑节对虾极孔样蛋白(ACV60547.1)相似性最高为75%。通过生物信息学分析发现,极孔样蛋白序列含有PbH1、EPTP两种结构域,且具有12个糖基化位点,23个跨膜结构。采用荧光定量PCR方法测定了其在卵巢和肝胰腺中不同发育时期相对表达水平,结果表明,极孔样蛋白基因在卵巢中的表达量明显高于肝胰腺。在卵巢中,第一期的表达量显著高于其它时期,且随着卵巢的发育表达量逐渐降低直到第六期稍有回升。在肝胰腺中除了第六期的表达量较低,其它时期相互之间无显著差异。实验结果为进一步研究凡纳滨对虾卵黄发生、卵巢发育机理提供了理论依据。
【图文】：

电泳图,肝胰腺,卵巢,电泳图

1-1 凡纳滨对虾卵巢与肝胰腺中总 RNA 电泳(1,2,3 取自卵巢，4,5,6 取自肝胰腺) Total RNA from ovaries and hepatopancreas of L. (1,2,3 from ovaries,4,5,6 from hepatopancreas)序列全长 2258bp，其中开放阅读框（opening r73 个氨基酸。在起始密码子上有 92bp 5’UTR，其中包括 poly（A）及加尾信号 AA登录号为：KT274811。

熔解曲线,基因

图 1-4（a）18s 熔解曲线Fig.1-4（a） Melt curve of 18s图 1-4（b）核自身抗精原蛋白基因熔解曲线Fig.1-4（b） Melt curve of NASP线
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4

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