miR-205介导铜诱导黄颡鱼肝脏脂肪沉积的研究

发布时间：2020-05-16 02:30

【摘要】：MicroRNA(miRNA)是一类长度为18~25nt(核苷酸)的非编码RNA,在各个物种之间具有高度保守性,且在生物体各组织中广泛存在,可在转录水平和翻译水平调控大量的靶基因。miRNA的表达具有时间特异性和组织特异性,在生长、发育、凋亡、自噬、脂肪代谢等方面发挥重要的调控作用。目前的研究表明,miRNA对鱼类脂肪代谢的调控方式主要是通过翻译调控,即通过“种子区”与被调控的脂代谢相关靶基因的3’UTR通过不完全互补配对的方式相结合,抑制靶基因翻译。铜(Cu)是鱼类必需的一种微量元素,参与鱼体多种生命活动,但过量富集时会对鱼体产生不利影响。目前的研究表明,铜对黄颡鱼脂肪代谢产生影响,但是其机制尚未完全清楚。铜暴露是否影响黄颡鱼体内miRNA的表达?miRNA是否介导了铜对黄颡鱼脂肪代谢的影响?本课题以黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)为研究对象,首先对其进行不同水体铜浓度的暴露实验,测得两个miRNA组,并对两个miRNA组进行生物信息学分析,筛选出铜暴露下差异表达的miRNA,对这些miRNA的靶基因进行预测、分析和验证,探讨了miRNA介导铜影响黄颡鱼肝脏脂代谢的机制。主要研究成果如下:1铜暴露下黄颡鱼肝脏差异表达miRNA的筛选为了研究铜暴露下黄颡鱼肝脏的差异表达miRNA,以两种水体Cu~(2+)浓度(对照组:1±1μg Cu~(2+)/L;处理组:62±5μg Cu~(2+)/L)养殖黄颡鱼幼鱼60 d,应用高通量测序测得铜暴露过后2个黄颡鱼肝脏miRNA组,得到172个已知miRNA(mature miRNA),5个新发现的miRNA(novel miRNA)。相比于对照组,铜处理组中显著差异表达(P0.05,|fold-chenge|≥2)miRNA共18个,其中2个(miR-212和chr20-5274)上调,16个(miR-203a、205、1788-3p、375、31、196a、203b-3p、2187-5p、196d、459-3p、153a、miR-725和2个novel-miRNA:chr4-1432、chr-7684)下调。通过TargetScanFish6.2预测差异表达miRNA的靶基因并与同时测得的黄颡鱼肝脏转录组关联分析,得到457个潜在的靶基因,对这些靶基因进行GO和KEGG分析,结果显示,这些靶基因显著富集在醚脂代谢、甘油磷脂代谢、亚油酸代谢和α-亚麻酸代谢途径中(P0.05),且大量靶基因与生物学过程相关;在富集分析时发现miR-205的靶基因与脂代谢相关通路有显著的关联(P0.05)。根据上述结果,我们预测miR-205介导了铜诱导的脂代谢变化,所以在后续研究中主要集中于miR-205。2 miR-205脂代谢相关靶基因验证为了进一步验证miR-205是通过调控哪些靶基因的特定位点与脂肪代谢产生直接或间接的关联,我们首先通过TargetScanFish6.2预测并结合黄颡鱼肝脏转录组联合筛选靶基因,筛选出脂肪酸合成酶fas、lxrα、ddit3、lamp2、caspcase3a和baxa包含有与miR-205潜在结合位点的3’UTR序列,然后通过克隆得到包含结合位点的上下游各200bp左右的序列,并将各个基因的片段分别重组到psiCHECK-2质粒中海肾荧光素酶(Ranilla Luciferase,Rluc)基因的3’UTR中not1与xhol酶切位点之间,构建野生型重组质粒,同时将靶基因的特定结合位点突变为GTCAGA,构建突变型重组质粒。最后通过miRNA mimics、miRNA NC与重组质粒共转染进HEK-293T细胞的方式进行双荧光素酶报告基因分析实验,验证出miR-205可以显著抑制WT-fas、WT-lxrα、WT-ddit3、WT-lamp2、WT-casp3a和WT-baxa的海肾荧光素酶酶活性(P0.05),但是对Mut-fas、Mut-lxrα、Mut-ddit3、Mut-lamp2、Mut-casp3a和Mut-baxa的海肾荧光素酶酶活性没有影响(P0.05),miR-205 NC对WTMUT-fas、lxrα、ddit3、lamp2、casp3a和baxa的荧光素酶活性均没有影响(P0.05)。结果表明,miR-205可以直接结合fas 3’UTR(1031-1052 bp)、lxrα(40-61 bp)、ddit3(171-192 bp)、lamp2(621-642 bp)、casp3a(542-563 bp)和baxa(406-427bp),并发挥抑制作用。fas、lxrα、ddit3、lamp2、casp3a和baxa是miR-205的直接靶基因。3 miR-205介导铜对黄颡鱼肝脏脂代谢的影响研究实验分为对照组、10μM Cu孵育、10μM LXR拮抗剂孵育和10μM Cu+10μM LXR拮抗剂共孵育组,孵育时间为24h和48h。以10μM的铜浓度暴露黄颡鱼原代肝脏细胞,结果显示,相比于对照组,铜处理组在24h和48h都显著抑制了miR-205的表达(P0.05),在miR-205被抑制后,其靶基因fas和ddit3的mRNA表达量发生显著上调(P0.05),LXRα的蛋白表达量显著上调(P0.05),脂肪酸合成酶(FAS)活性与甘油三酯(TG)含量显著上升(P0.05);细胞内脂滴的数量和体积都显著增大(P0.05);在单独LXR拮抗剂作用下,FAS的活性、TG含量细胞内脂滴的数量和大小显著下降(P0.05);但在铜和LXR拮抗剂同时作用下FAS的活性、TG含量没有显著变化(P0.05),细胞内脂滴的数量和大小没有显著性变化(P0.05)。实验结果表明,铜暴露抑制黄颡鱼肝脏细胞中miR-205的转录,使其对靶基因lxra的翻译抑制作用显著下降,导致LXRα蛋白量增加,进而激活了脂肪合成相关通路,使FAS活性、TG含量、细胞内的脂滴数量和体积上升,造成肝细胞内脂肪沉积。综上所述,本实验研究表明miR-205通过靶向lxra介导了铜诱导的黄颡鱼肝脏脂质沉积。水体铜暴露抑制了黄颡鱼肝脏内miR-205的表达,使miR-205对下游靶基因lxrα、fas的翻译抑制作用减弱,使细胞内FAS活性上升,TG含量增加直接造成细胞内脂肪沉积;通过削弱对下游的ddit3、casp3a、baxa和lamp2的抑制作用,进而从内质网应激、细胞凋亡、自噬等途径,间接影响了黄颡鱼肝脏的脂肪代谢。
【图文】：

序列,生物合成,靶基因

图 1-1 miRNA 的生物合成（Faller et al 2008）Fig.1-1 miRNA biogenesis (Faller et al 2008)miRNA 的作用方式miRNA-靶基因的作用方式主要是通过识别miRNA与靶基因部其结合位点通常位于靶基因 mRNA 的 3’UTR 中，介导基因的004)。miRNA 的 5’端的“种子区”既第 2-7 个核苷酸与靶基因结发靶基因沉默(Grimson et al 2007)。有研究认为，miRNA：mR形成位置可能影响 miRNA 对靶基因的沉默效率 (Sandberg et a miRNA 结合位点，互补性仅限于种子序列或种子序列加 miRN而，在特殊情况下，特别是当 mRNA 具有弱种子匹配时，miR因的互补性可能会有助于 miRNA 靶标选择(Huntzinger et al 201 miRNA5’末端核苷酸若是埋藏在 AGO 蛋白包被的中间区域，

碱基配对,靶标,脂质代谢

图 1-2 miRNAs 通过 Watson-Crick 碱基配对识别其靶标 (Huntzinger et al 2011)Fig. 1-2 miRNAs recognize their targets by Watson Crick base pairing (Huntzinger et al 2011)1.4 miRNA 与脂肪代谢miRNA 在脂肪细胞的分化、脂肪合成和氧化的过程中发挥重要作用（Esau et al2006, Rottiers et al 2012, Cui et al 2017）。对调节脂质代谢发挥作用的 miRNA 包括miR-122、miR-370、miR-378、miR-335、miR-125a-5p 和 miR-33 等。miR-122 可以直接调控参与脂肪酸合成和氧化的几个基因（fas、acc1 和 acc2） (Elmén J et al 2008,Esau et al 2006)。高脂饲料喂养的小鼠体内 miR-122 的表达量下降，介导了胆固醇合成的减少和脂肪酸氧化，从而减少了肝脏脂肪变性 (Esau et al 2006)。miR-370 对脂质代谢的调节作用与 miR-122 类似，miR-370 可以靶向肉毒碱棕榈酰转移酶（Carnitine palmitoyltransferase 1a ，Cpt1a），阻碍长链脂肪酸在线粒体的入膜转运，，从而减少脂肪酸的氧化(Iliopoulos et al 2010)。miR-370 转染人肝细胞系 HepG2，导
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S917.4

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