赖氨酸添加对菲牛蛭生长和抗凝酶活性影响研究

发布时间：2020-05-19 22:11

【摘要】：本研究以菲牛蛭(Poecilobdella manillensis)为研究对象,旨综合饲料学、酶学和分子生物学的研究方法,研究了广西菲牛蛭和广东菲牛蛭的遗传背景,并研究了血液、配合饲料和赖氨酸添加对菲牛蛭生长、抗氧化指标、非特异性免疫指标、水蛭素活性及水蛭素基因(HM)表达的影响。主要研究结果如下:1、基于COⅠ和18S rDNA部分序列分析粤、桂2个菲牛蛭种群的遗传多样性采用PCR扩增技术测定了广东广西共35尾菲牛蛭COⅠ和18S rDNA部分序列,并对COⅠ和18S rDNA部分序列进行对比分析。结果显示:COⅠ基因共检出9个变异位点,定义单倍型9个;广西菲牛蛭单倍型多样性(0.737)和核苷酸多样性(0.00166)高于广东菲牛蛭(0.638,0.00119)。18S rDNA基因共检出1个变异位点,定义单倍型3个;广东菲牛蛭单倍型多样性(0.154)和核苷酸多样性(0.00014)高于广东菲牛蛭(0.1100,0.0001)。COⅠ基因单倍型之间的遗传距离在0.0015~0.0077之间,18S rDNA单倍型之间的遗传距离在0.0009~0.0018之间。COⅠ和18S rDNA优势单倍型广西所占比例分别为60%和58.6%。结果表明:广西菲牛蛭遗传多样性水平高于广东菲牛蛭。2、配合饲料和血液对菲牛蛭水蛭素活性、抗氧化指标及非特异性免疫指标的影响研究采用生化方法测定了配合饲料组和血液组菲牛蛭水蛭素活性、抗氧化指标(SOD、CAT、MDA)和非特异性免疫(AKP、ACP、LSZ)。结果显示:配合饲料组水蛭素活性略低于血液组,差异性不显著(P0.05);配合饲料组肠道超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性显著高于血液组肠道SOD和CAT活性(P0.05),配合饲料组肠道丙二醛(MDA)含量稍低于血液组,配合饲料组嗉囊SOD活性显著低于血液组(P0.05),CAT活性稍低于血液组,而配合饲料组的嗉囊MDA含量显著低于血液组(P0.05)。肠道组织中,配合饲料组溶菌酶(LSZ)活性显著低于血液组(P0.05),而碱性磷酸酶(AKP)和碱性磷酸酶(ACP)活性显著高于血液组(P0.05);嗉囊组织中,配合饲料组LSZ活性稍低于血液组,而AKP和ACPA稍高于血液组,差异不显著(P0.05)。研究表明:菲牛蛭能摄食配合饲料,水蛭素活性未受影响;对肠道抗氧化能力有一定的增强作用,在MDA、AKP和ACP含量能达到或超过血液饲养水平。3、几种氨基酸的筛选及水蛭素活性的测定以赖氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、牛磺酸、谷氨酸和组氨酸为目标氨基酸,分别配制成1g/kg、2g/kg和3g/kg的浓度梯度对菲牛蛭养殖试验。结果显示:赖氨酸添加摄食效果最好,其他添加组经过第一次摄食后不摄食或少量摄食。水蛭素活性赖氨酸添加组从低浓度组到高浓度组呈现先上升后下降的趋势,且在添加浓度为2g/kg时,水蛭素活性最高(165.6U/g),且稍高于血液对照组(162.5U/g),其他添加组水蛭素活性无规律。综合分析菲牛蛭的摄食情况及水蛭素活性,筛选出赖氨酸进行后续的养殖实验。4、配合饲料中赖氨酸添加对菲牛蛭生长及相关因子的影响以赖氨酸为目标氨基酸,分别配制成0g/kg、0.7g/kg、1.4g/kg、2.1g/kg的浓度梯度,以血液为对照组,对菲牛蛭进行为期37d的饲养。采用生物统计、生化、RT-PCR与荧光定量PCR技术等方法研究了赖氨酸添加对菲牛蛭生长、抗氧化指标、非特异性免疫指标、水蛭素活性及水蛭素基因(HM)表达的影响。结果显示:(1)配合饲料中添加赖氨酸后的特定生长率(0.77~0.82)显著高于不添加组(0.60)(P0.05),添加组增重率(29.76%~32.12%)显著高于不添加组(22.67%)(P0.05),特定生长率和增重率均显著低于血液组;添加赖氨酸浓度为1.4g/kg时,特定生长率(0.82)和增重率(32.12%)最高。(2)在肠道和肌肉组织中,未添加组SOD活性显著高于血液组(P0.05);添加组中随着赖氨酸浓度的升高,SOD呈“上升-下降”趋势,添加浓度为1.4g/kg时,SOD酶活性最高,且显著高于血液组(P0.05);在肠道组织中,当赖氨酸添加为1.4g/kg时,CAT含量最高,在肌肉和嗉囊组织中,在浓度为1.4g/kg时,CAT活性与血液组无显著差异(P0.05)。MDA含量添加组、未添加组和血液组之间不存在显著差异(P0.05),肌肉组织和嗉囊组织呈现出“高低交错”现象,菲牛蛭MDA含量基本处于平衡状态。添加组LSZ、ACP、AKP活性高于血液组,在赖氨酸添加为1.4g/kg时,总AKP酶活性最高和肌肉组织中的AKP酶活性最高,且显著高于血液对照组(P0.05)。(3)未添加组水蛭素活性和水蛭素基因(HM)相对表达量显著低于添加组(P0.05),在赖氨酸添加实验中,随着赖氨酸浓度的升高,水蛭素活性和水蛭素基因相对表达量呈现相同的变化趋势,先升高后降低;添加浓度为1.4g/kg时,水蛭素活性(285.52±5.68U/g)和水蛭素基因(HM)表达量最高(0.76±0.03);且和血液组差异不显著。研究表明:适宜浓度的赖氨酸添加可以有效的提高菲牛蛭的生长、抗氧化能力和免疫功能,并能促进水蛭素活性升高和水蛭素基因的表达。综合分析,得到菲牛蛭赖氨酸适宜的添加浓度为1.4g/kg。
【图文】：

氨基酸序列,天然水,一级结构,水蛭素基因

与马尼拉菲牛蛭水蛭素基因 Hm1、Hm2 的同源性分别为 90%、88.6%。黎渊弘等（2011）从广西菲牛蛭中得到水蛭素基因 cDNA 序列长度为 251 bp，编码框由 83 个氨基酸组成，包括 20 个氨基酸组成的信号肽，63 个氨基酸组成的成熟肽。广西菲牛蛭水蛭素基因的氨基酸序列和广东菲牛蛭、马尼拉菲牛蛭水蛭素基因的氨基酸序列相比较，同源性分别为 94%、91.8%、84.7%。

结构图,水蛭素,结构图,水蛭素基因

与马尼拉菲牛蛭水蛭素基因 Hm1、Hm2 的同源性分别为 90%、88.6%。黎渊弘等（2011）从广西菲牛蛭中得到水蛭素基因 cDNA 序列长度为 251 bp，编码框由 83 个氨基酸组成，，包括 20 个氨基酸组成的信号肽，63 个氨基酸组成的成熟肽。广西菲牛蛭水蛭素基因的氨基酸序列和广东菲牛蛭、马尼拉菲牛蛭水蛭素基因的氨基酸序列相比较，同源性分别为 94%、91.8%、84.7%。
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4

【参考文献】