【摘要】：非特异性细胞毒性细胞(NCC)是哺乳动物自然杀伤细胞的前体细胞,在鱼类先天性免疫中发挥着重要作用。非特异性细胞毒性细胞受体Ⅰ型(NCCRP-1)是该类细胞膜上关键的受体蛋白,是NCC发挥功能的分子基础。然而目前对于NCCRP-1介导的NCC活性调控网络与作用机理还缺乏系统的研究。为揭示鱼类NCC活性调控的作用网络及分子机理,本论文以南方主要养殖品种——尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)为研究对象,从以下三方面开展了研究工作:(一)通过酵母双杂交文库法筛选NCCRP-1的互作蛋白,随后采用点对点酵母双杂交进行验证;(二)通过分析鉴定得到的互作蛋白其对NCC的活性调控作用,初步阐明了NCCRP-1介导的NCC活化信号转导通路;(三)针对发现的新型激活型配体分子CD80/86的功能以及NCC的效应分子NK-lysin进行了初步探究。取得的主要研究结果如下:1、罗非鱼NCCRP-1的表达特征及其互作蛋白的获取和验证获得罗非鱼NCCRP-1(On-NCCRP-1)的c DNA序列和基因组序列,并发现On-NCCRP-1在NCC的全细胞均有分布。q RT-PCR分析发现,On-NCCRP-1在罗非鱼的肝脏和头肾组织有较高分布。不同刺激物刺激后,On-NCCRP-1的表达量在各组织及NCC中均出现显著性上调。结果表明On-NCCRP-1作为NCC受体分子,在介导鱼类免疫应答中起着重要作用。根据On-NCCRP-1的基因序列特征分别构建NCCRP-1全长、胞外结合区域以及胞内转录活化区+信号转导区三个酵母双杂交诱饵质粒,并构建罗非鱼头肾与肝脏酵母双杂交c DNA文库。利用三个诱饵载体分别从肝脏和头肾c DNA文库中筛选潜在互作蛋白。最终获取11个与NCCRP-1有潜在相互作用的基因序列片段,最终克隆获得10个基因的ORF序列。进一步使用酵母双杂交技术对此10个基因与NCCRP-1进行点对点验证,发现On-NCCRP-1可与罗非鱼C-type lectin(On-C-type lectin)、罗非鱼serotransferrin(On-serotransferrin)相互作用。结果成功获得两个胞外蛋白分子可与On-NCCRP-1相互结合。2、依赖于NCCRP-1受体介导的NCC活性调控罗非鱼On-C-type lectin具有凝集素家族典型的CRD结构域。q RT-PCR分析发现,其广泛分布于罗非鱼多个组织,且在肝脏中表达量最高。无乳链球菌刺激后,On-C-type lectin在多个组织中均于早期发生显著性上调,表明该基因在细菌感染早期的免疫应答中发挥重要作用。利用On-C-type lectin和On-serotransferrin重组蛋白对体外分离的NCC进行刺激,发现3 h和6 h均可诱导部分NCC毒性效应分子高表达,表明NCC被激活。同时用诱导3 h的NCC对FHM细胞进行毒性实验,发现On-C-type lectin和On-serotransferrin重组蛋白均可有效诱导FHM细胞凋亡信号开启,而使用抗On-NCCRP-1抗体封闭On-NCCRP-1,可抑制NCC对FHM的杀伤活性。结果表明,On-C-type lectin和On-serotransferrin均可通过受体On-NCCRP-1介导NCC的杀伤活性。酵母双杂交实验发现On-NCCRP-1可与On-SKP1相互结合,而Skp1-Cul1-F-box protein(SCF)泛素连接酶复合物在催化蛋白泛素化过程中起着重要作用,结果表明On-NCCRP-1可能会介导泛素化作用。双荧光素酶报告系统检测发现,On-NCCRP-1过表达可激活NF-κB转录活性。推测On-NCCRP-1可能与On-SKP1结合后参与泛素化作用,进一步促进NF-κB抑制物IκB的降解,从而有效促进NF-κB信号转导。3、不依赖于NCCRP-1受体介导的NCC活性调控分析了罗非鱼CD80/86基因(On-CD80/86)和CD28基因(On-CD28)的结构特征。q RT-PCR结果显示,On-CD28和On-CD80/86可在罗非鱼各组织中检测到,且分别在胸腺和心脏中表达量最高。无乳链球菌刺激后,On-CD28和On-CD80/86在多种组织中表达量均显著上调。然而,对头肾组织淋巴细胞刺激后发现,On-CD28和On-CD80/86表现出不同的表达特征。体外互作实验表明On-CD80/86可与On-CD28相互作用,但不能和On-NCCRP-1相结合。且发现On-CD80/86不依赖于受体NCCRP-1介导即可诱导NCC效应分子的表达,以及提高NCC对CIK细胞的杀伤作用。以上结果表明On-CD80/86与On-CD28互作为罗非鱼T细胞活化提供共刺激信号,而On-CD80/86也可能是一种不依赖于On-NCCRP-1受体的新型NCC激活型配体,在罗非鱼抵抗病原微生物感染时提供重要帮助。4、NCC效应分子NK-lysin的序列分析及其功能研究本研究首先从罗非鱼体内克隆获得鞘脂激活样蛋白直系同源物NK-lysin(On-NKL)。q RT-PCR的结果表明On-NKL存在于罗非鱼的多种组织以及头肾淋巴细胞和NCC中,且在鳃中表达量最高。无乳链球菌刺激后,On-NKL在罗非鱼的头肾、脑、脾脏、体肾、肠以及NCC中的表达模式都呈现出时间依赖性的关系。On-NKL过表达组的罗非鱼脾脏组织中的细菌定植量显著低于对照组,同时发现,对于攻毒后的20天内On-NKL过表达组的罗非鱼死亡率明显低于对照组,结果表明On-NKL可能是鱼类NCC的潜在效应分子,在鱼类抗细菌感染过程中起着重要作用。
【图文】：
2.2 结果与分析2.2.1 On-NCCRP-1 序列分析获取的 On-NCCRP-1 的 cDNA 全长 1045 bp（GenBank 登录号：MF162296），On-NCCRP-1 包括 90 bp 的 5`非翻译区（UTR），702 bp 的 ORF 编码 233 aa，253 bp的 3`UTR，以及假定的聚腺苷酸化信号（AATAAA）位于其 poly（A）尾部上游 17-21bp 处（图 2-1）。预测的 MW 为 26.55 kDa，理论 pI 为 5.76。软件分析表明（用 SignalP程序和TMHMM），On-NCCRP-1没有信号肽或跨膜区，多序列比对发现，On-NCCRP-1与其他物种的序列同源性介于 55 %~85 %之间。在 N-末端含有称为“box-1（”PxPxxP）和“box-2”（PxP）的富含脯氨酸的基序（PRM）像其他鱼 NCCRP-1，，所有 NCCRP-1从 鱼 检 查 具 有 的 F-box 相 关 （ FBA ） 结 构 域 以 及 推 定 的 抗 原 识 别 位 点（LPxxxWFxxEQxVxLKA）在各鱼当中都较为保守。On-NCCRP-1 基因组序列全长4471 bp，含有 6 个外显子和五个内含子。
图 2-2 On-NCCRP-1 氨基酸序列与其它已知的 NCCRP-1 序列的多序列比对氨基酸残基用黑色背景表示; 氨基酸残基一致性≥75%用灰色表示; 每条氨基酸序列末尾的百表 NCCRP-1 氨基酸序列与其的同源性.igure 2-2 Alignment of deduced amino-acid sequences of On-NCCRP-1 homologsensus residues are in black. Residues that are ≥75% identical among aligned sequences are in grey.llowing each amino-acid sequence represents overall sequence identity between On-NCCRP-1 and sequences.图 2-3 各物种 NCCRP-1 内含子/外显子结构图示方框代表外显子; 线条代表内含子; 数字代表相应的核苷酸长度; 黑色方框分别代表 5`和 3`Uure 2-3 NCCRP-1 intron/exon organization along with different NCCRP-1 struc
【学位授予单位】：广东海洋大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4
【参考文献】
相关期刊论文 前10条
1 李莉萍;王瑞;梁万文;黄婷;罗永巨;雷爱莹;甘西;陈明;;罗非鱼无乳链球菌弱毒株与其母源株部分生物学特性及免疫原性比较研究[J];西南农业学报;2015年05期
2 杨智景;李长红;张浩;苗亮;陈炯;;香鱼(Plecoglossus altivelis)肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因的分子克隆、鉴定及免疫相关性表达[J];海洋与湖沼;2015年06期
3 蔡佳;代礼平;王蓓;汤菊芬;黄郁葱;鲁义善;吴灶和;简纪常;;草鱼(Ctenopharyngodon idellus)NCCRP-1基因的克隆和原核表达[J];生物技术通报;2013年11期
4 吴南;张永安;;鱼类自然杀伤样细胞的研究进展[J];水生生物学报;2012年06期
5 魏世娜;王蓓;鲁义善;吴灶和;简纪常;;红笛鲷NCCRP-1基因原核表达条件的优化及纯化[J];广东海洋大学学报;2010年06期
6 魏世娜;简纪常;吴灶和;鲁义善;闫秀英;;鱼类非特异性细胞毒性细胞(NCC)的研究进展[J];中国水产科学;2010年02期
7 张新艳;樊海平;钟全福;卓玉琛;林煜;曾占壮;;罗非鱼无乳链球菌的分离、鉴定及致病性研究[J];水产学报;2008年05期
8 任亚琳;;B7-CD28家族成员的免疫调节功能及其最新研究进展[J];国外医学(免疫学分册);2005年06期
9 GRUYS E.,TOUSSAINT M.J.M.,NIEWOLD T.A.,KOOPMANS S.J.;Acute phase reaction and acute phase proteins[J];Journal of Zhejiang University Science;2005年11期
10 陈晓黎,康安静;B7共刺激信号家族研究进展[J];国外医学(免疫学分册);2003年02期
相关博士学位论文 前2条
1 郑哲;基于多组学分析的马氏珠母贝矿化相关基因研究[D];广东海洋大学;2017年
2 杨长庚;大菱鲆（Schophthalmus maximus）、牙鲆（Paralichthys olivaceus）免疫相关基因的克隆及其性质与功能的研究[D];中国海洋大学;2011年
相关硕士学位论文 前2条
1 夏洪丽;红笛鲷TRAF3基因的克隆、表达及功能研究[D];广东海洋大学;2015年
2 黄瑜;红笛鲷lck和tdt基因的克隆及表达分析[D];广东海洋大学;2013年
本文编号：
2674380
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/scyylw/2674380.html
